产胞外多糖乳酸菌的筛选及其芒果风味发酵乳的制备

关成冉，赵瑞峰，马雁，陶志强，黄欣媛，苏剑波，王智斌，伍云，陆震，顾瑞霞

（1.扬州大学 江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏 扬州225127；2.广西水牛乳工程技术研究中心，南宁530000；3.华熙生物科技有限公司，济南250101）

0 引 言

研究表明，乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）不仅能增加发酵乳的黏度，减少乳清析出，提高发酵乳的回复性和抗剪切力[1]，还能显著提高发酵乳的持水力[2]，是一种天然的增稠剂。EPS是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的粘液或荚膜多糖[3]，除了被用作食品添加剂外，还具有抗氧化[4]、降低胆固醇[5-6]、免疫调节[7]、抑制黑色素[8]形成、抗肿瘤[9]及保护肠道内的有益菌体免受毒害[10-11]等功能特性。芒果酱富含多种营养成分，同时具有独特的风味和口感。本研究拟筛选高产EPS的乳酸菌菌株，在此基础上优化条件，制备一款质地粘稠且具有芒果清爽香味的发酵乳，为高产EPS的乳酸菌用于发酵乳的生产提供一定的参考。

1 实 验

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

芒果酱、蔗糖，脱脂乳粉，全脂乳粉，MRS培养基，质量分数12% 脱脂乳培养基，胰蛋白酶，酚酞、苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、无水乙醇、氯仿、正丁醇等均为国产分析纯。

实验菌株：植物乳杆菌S7；发酵乳杆菌BF；嗜热链球菌有Y430A，937-1，g2，LPRA-3，489-1，XP1-1-1，393-2由江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室筛选鉴定。

1.1.2 仪器与设备

JF-SX-500全自动灭菌锅，GYB60-08型高压均质机，ZHJH-C1209B智能安全型超净工作台，生化培养箱，HH-6数显恒温水浴锅，质构仪，酶标仪，台式冷冻离心机，旋转流变仪。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 菌种的活化

将-80℃冰箱的冻干菌粉用MRS培养基在37℃恒温培养箱培养24 h，置于4℃备用。

1.2.3 乳酸菌胞外多糖的提取与测定

乳酸菌胞外多糖（EPS）的提取（粗多糖）及测定参考文献[12]中方法，胞外多糖样品用10 mL蒸馏水溶解，采用硫酸-苯酚法测定胞外多糖的质量浓度，用葡萄糖制作标准曲线。EPS质量浓度测定的具体方法：吸取样品0.2 mL，加入蒸馏水0.8 mL，后加入6% 的苯酚0.5 mL和浓硫酸3.0 mL，沸水浴20 min，冷却至室温，用酶标仪于490 nm测吸光度，EPS质量浓度由标准曲线的回归方程和稀释倍数换算出。

1.2.4 制备条件对芒果风味发酵乳品质的影响

（1）不同比例混合接种量对EPS产量及发酵乳的影响。在37℃恒温培养，发酵时间7 h，全脂乳添加量为12% ，蔗糖添加量为5% ，芒果添加量为6% ，2株乳酸菌分别按3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3的比例混合后按3% 无菌接入全脂乳中，发酵结束后置于4℃冷藏后酸化12 h，提取EPS并测定其含量，由EPS产量和感官评价选出最优的菌株配比。

（2）温度对EPS产量及发酵乳的影响。发酵时间7 h，全脂乳添加量为12% ，蔗糖添加量为5% ，芒果添加量为6% ，将混合菌株按3% 接入配制好的全脂乳中，分别放在31，34，37，40，43℃和46℃发酵，发酵结束后置于4℃冷藏后酸化12 h，提取EPS并测定其含量，由EPS产量和感官评价选出最优的菌株配比。

（3）芒果酱的添加量对EPS产量及发酵乳的影响。在37℃恒温培养，发酵时间7 h，全脂乳添加量为12% ，蔗糖添加量为5% ，芒果酱添加量分别为5% ，6% ，7% ，8% ，9% 和10% ，混合菌株按3% 接入配制好的全脂乳中，发酵结束后置于4℃冷藏后酸化12 h，提取EPS并测定其含量，由EPS产量和感官评价选出最优的菌株配比。

1.2.5 正交实验优化的制备条件

为了研究菌株配比、温度、芒果酱添加量对芒果风味发酵乳风味的影响，按照表1以菌株配比（A）、温度（B）、芒果酱添加量（C）为变量进行正交试验，以测定芒果发酵乳的EPS产量为试验结果，确定制备芒果发酵乳的最佳条件。

表1 正交实试验的因素与水平

1.2.6 测定指标及方法

发酵乳酸度、活菌数的测定按照国标规定的方法测定[13]。

1.2.7 持水力的测定

持水力测定方法如下：离心管质量m1（g），发酵乳样品装入离心管质量m2（g），离心15 min，转速为3 500 r/min，去除上清液称质量m3（g），按下式计算：

1.2.8 全质构TPA实验参数设计

利用TMS-PRO质构仪测定样品的硬度、黏附性、弹性和咀嚼性，设置参数为：圆柱探头12.7 mm，触发力0.5 N，测试速度60 mm/min，形变量50% 。

1.2.9 芒果风味发酵乳表观黏度的测定

利用Malvern Kinexus Pro旋转流变仪，选用CP2/50 SR 0162 SS锥板，参照王娜[14]对样品的触变性和表观黏度进行测定，并略作改动。在恒温25℃、恒定剪切速率1.0 s-1条件下，剪切时间为2 min，每10 s收集1个数据点，检测样品的表观黏度与时间的关系。

1.2.10 芒果风味发酵乳感官评价

由12位研究生对芒果风味发酵乳进行感官评分。采用10分制，感官评定具体标准如表2所示。

表2 芒果发酵风味乳感官评分标准

1.2.11 数据分析

采用SPSS 25软件和Origin 2107分别进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 芒果风味发酵乳发酵菌株的筛选

2.1.1 葡萄糖标准曲线

根据硫酸-苯酚法测定多糖的含量，用葡萄糖绘制标准曲线，结果如图1所示。得出标准曲线的回归直线方程为y=0.0098x-0.02046，R2=0.9968，胞外多糖的浓度可根据稀释倍数和标准曲线方程换算出。

图1 葡萄糖标准曲线

2.1.2 发酵乳发酵菌株的筛选

为了筛选出高产EPS的乳酸菌菌株，提取并测定9株乳酸菌EPS的质量浓度，结果如图2所示，9株乳酸菌EPS的产量质量浓度都大于100 mg/L，其中EPS产量最高的菌株为S7，其EPS产量是产量最低菌株LPRA-3产量的2.7倍；筛选出EPS产量最高的5株乳酸菌依次为S7，BF，Y430A，937-1和g2。

图2 不同乳酸菌EPS产量

把进一步将这5株乳酸菌用于发酵产酸特性研究，结果如图3所示。由图3可以看出，937-1和S7发酵6 h即可凝乳，凝乳时间少于其他3株菌；同时，这两株菌发酵产酸的速度显著大于其他3株乳酸菌，因此选用937-1和S7作为芒果风味发酵乳的混合发酵剂。

2.2 单因素实验确定EPS的制备条件对品质的影响

2.2.1 不同比例的混合发酵剂对EPS产量及发酵乳的影响

为了确定芒果风味发酵乳中发酵剂的最适配比，将937-1和S7按照不同的比例混合，测定不同比例的混合乳酸菌EPS的产量，结果如图4所示，EPS产量最高的菌株配比为2∶1，其产量是最低配比产量的1.5倍，同时该比例所生产的发酵乳感官评分也最高，因此选择此配比的混菌用于芒果风味发酵乳的制备。

图3 不同乳酸菌的发酵产酸特性

图4 不同乳酸菌菌株配比的EPS产量

2.2.2 发酵温度对EPS产量及发酵乳的影响

为了确定芒果风味发酵乳的最佳发酵温度，测定乳酸菌在不同的发酵温度下EPS的产量，并进行感官评分，结果如图5所示，7种温度下EPS的产量都大于600 mg/L，在37℃发酵时EPS产量最高；在49℃发酵时，EPS产量最低，可能是温度过高导致细胞活力不足从而使EPS合成减少。结合感官评价，选择37℃为芒果风味发酵乳的发酵温度。

图5 不同培养温度下的EPS产量

2.2.3 芒果酱添加量对EPS产量及发酵乳的影响

测定不同的芒果酱的添加量对发酵乳EPS产量影响，结果如图6所示，可以看出EPS的产量随着芒果酱的增加而升高，当芒果酱的添加量为10% 时，EPS的产量降低，同时发酵乳感官评分开始下降，口感偏甜，这可能是芒果酱自身具有一定的甜度，导致发酵乳过甜，芒果酱添加量为9% 时，EPS的产量和感官评分都达到最高，EPS产量最高，发酵乳口感细腻，酸甜适宜，无乳清析，因此，芒果酱的添加量为9% 。

图6 不同芒果酱添加量下的EPS产量

2.3 正交实验优化制备条件

为优化芒果风味发酵乳的制备条件，对发酵菌株配比、发酵温度及芒果酱添加量进行正交实验，结果如表3所示。由表3可以看出，各因素的主次关系为A（菌株配比）＞B（温度）＞C（芒果酱添加量）；因素A显著影响发酵乳的感官评分和EPS的产量，因素B对发酵乳的感官评分和EPS产量的影响次于A，因素C对发酵乳的感官评分和EPS产量无显著影响；从k值得出芒果风味发酵乳制备最佳条件为A2B1C2，即菌株配比为2∶1，温度为37℃，芒果酱的添加量为8% ，此时EPS质量浓度最高，达到834.0 mg/L；芒果风味发酵乳组织状态均匀，乳白色中带些淡黄色，具有芒果的清爽香味，口感细腻，酸甜可口。

表3 正交实试验结果

2.4 贮藏期间酸度和活菌总数的变化

测对芒果风味发酵乳贮藏期间酸度（图7a）和活菌数（图7b）的变化进行测定，发酵乳的酸度随着贮藏时间的延长而增大，在贮藏12 d内，酸度上升较快，由68.9°T增加到86.7°T，之后缓慢增加，18 d时酸度达到92.6°T。活菌数随着贮藏时间的延长呈先上升后下降的趋势，在贮藏10 d内，活菌总数逐渐上升，由8.2×108mL-1增加到9.1×108mL-1，贮藏10 d后，芒果风味发酵乳的活菌数迅速减小，18 d时活菌数减少到7.4×108mL-1，但依然大于国标中对活菌数的要求（1×106mL-1）。贮藏9 d后活菌数逐渐减少可能是随着酸度的增加p H值下降，低p H值条件不利于乳酸菌的生长甚至导致乳酸菌的死亡。

图7 发酵乳贮藏期间的酸度和活菌数的变化

2.5 贮藏过程中的持水性

测定芒果风味发酵乳在贮藏过程中的持水性，结果如图8所示。在贮藏14 d内持水性由55.8% 增加到61.2% ，这可能是乳酸菌产生的EPS增加了发酵乳的持水性，减少了乳清析出。产EPS的发酵乳含有相对大的孔，EPS在这些微孔里使蛋白质网络形成更厚由更浓密的蛋白质凝胶所形成的凝胶通道，这种结构更有利于防止发酵乳脱水析出[15]；在14 d后，发酵乳中酪蛋白构成的凝胶网状立体结构变得疏松，引起蛋白质胶体分子团之间的作用力减弱，使酪蛋白胶体结合水含量减少[16]，从而导致发酵乳的持水力有轻微的下降。

图8 发酵乳储藏过程中持水性变化

2.6 贮藏过程中质构变化

图9 发酵乳储藏过程中质构变化

测定储藏过程中芒果风味发酵乳的质构，包括硬度（图9a）、黏附性（图9b）、弹性（图9c）和咀嚼性（图9d）。随着贮藏时间的延长，发酵乳硬度由开始的0.278 N减少到0.160 N，弹性由26.90 mm增加到34.12 mm，黏附性由0.723 mJ减少到0.313 mJ，咀嚼性由开始的5.95 m J减少到4.36 m J。硬度是使物体发生形变所需要的力，弹性表示物体在外力作用下发生形变，当撤销外力后恢复原来状态的能力，EPS的存在会阻碍了酪蛋白之间的相互作用，从而降低发酵乳的凝胶强度，提高发酵乳的弹性[16]；而咀嚼性是硬度和弹性综合作用的结果，随着贮藏期的延长而下降。

2.7 贮藏过程中的表观黏度

黏度是流体食物（如发酵乳、饮料）的一个重要特性，它会影响流体食物的口感和质地[17]。选取0，6，12 d和18 d的样品进行分析（图10）。4组样品都随着剪切时间的延长，剪切速率的逐渐增大，表观黏度逐渐下降，最后趋于平稳，表现出非牛顿流体特性，即黏度随着剪切速率的增大而减小的假塑性和切稀现象。刚开始时，剪切速率较小，发酵乳内部的凝胶结构未被完全破坏，随着时间延长，剪切速率增大，发酵乳内部的凝胶结构被破坏，使网络结构内的静电力、疏水力之间的相互作用被减弱[18-19]，表现出切稀现象。贮藏过程中，表观黏度在12 d时达到最大，18 d表观黏度稍有降低，但依然大于第6 d的表观黏度，说明制备的芒果风味发酵乳在贮藏期间的稳定性较好。

图10 发酵乳储藏过程中表观黏度变化

3 结 论

本研究从实验室9株乳酸菌中筛选出2株高产EPS且发酵特性适宜的乳酸菌用于芒果发酵乳的制备，利用单因素实验、正交实验设计及感官评定确定芒果风味发酵乳的制备条件。当菌株S7与937-1的配比为1∶2，发酵温度为37℃，芒果酱的添加量为8% 时，制备的芒果风味发酵乳中EPS的产量高达834.0 mg/L，发酵乳口感顺滑、酸甜适宜，有特殊的芒果香味；在贮藏20 d后，芒果风味发酵乳的酸度达到92.6°T，活菌数达到9.1×108mL-1，远高于国标中发酵乳的活菌数1×106mL-1。