激光扫描共聚焦显微镜对涡状区和中央区角膜上皮基底神经丛检测一致性比较

于花 苗英彬 赵少贞

角膜上皮基底神经丛在维持角膜的敏感性、保护角膜上皮的完整性及促进上皮细胞的增殖和修复方面具有重要的作用[1]，其形态学观察与分析对多种眼表疾病的诊断和疗效评价具有重要意义。以往的研究通常利用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy，LSCM)对中央区的角膜上皮基底神经丛进行分析。但是，由于LSCM观察视野小，且缺乏定位功能，每次测量的确切位置并不明确，使得不同患者或同一患者在不同时间采集的图像变异较大，可靠性较差。这种误差在疗效评价和随访研究中表现得尤为突出。因此，亟需挑选合理的检查部位和查找目标，提高设备参数的可靠性与可重复性，从而提升LSCM检查的临床指导价值。近年来有研究发现，角膜上皮基底神经丛呈放射状向中央聚集，在角膜顶点的鼻下方形成一个涡状结构[2]。由于这一结构形态特殊，能成为重复测量的良好标志。本研究通过比较中央区和涡状区角膜上皮基底神经丛测量结果的一致性，筛选出更加合理可靠的检查部位，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料前瞻性研究。2018年11月至2019年2月募集年龄在20～40岁的健康志愿者作为研究对象。纳入标准：(1)年龄20～40岁；(2)眼压正常；(3)裂隙灯检查眼表无明显炎症，角膜光滑、透明。排除标准：干眼病史；角膜接触镜配戴史；眼外伤及眼部手术史；翼状胬肉、圆锥角膜、过敏性结膜炎、感染性角结膜炎、青光眼病史或眼部持续用药史者；以及患有任何影响神经功能的系统性疾病者(如糖尿病、脑梗、甲状腺功能亢进等)。最终共纳入受试者30人，其中男10人，女20人，年龄(30.53±4.93)岁。本研究经山西省眼科医院伦理委员会审核批准(伦理号：201804b)，取得受试者知情同意后进行检查。

1.2 方法

1.2.1 LSCM检查使用海德堡Ⅱ代激光断层扫描系统(HRT-Ⅱ)(德国海德堡工程有限公司)的Rostock角膜模块完成。入组受试者均选择右眼为受检眼。由2名经验丰富的医师共完成3次检查。首先于检查当天由操作者A和操作者B各完成1次检查，1周后再由操作者A重复检查1次。检查使用2 g·L-1卡波姆滴眼液(唯地息，德国格哈德博士曼医药化工有限公司)作为角膜接触帽与镜头之间的耦合剂。受试者用2 g·L-1丙美卡因(爱尔凯因，美国爱尔康公司比利时分公司)表面麻醉后，左眼注视正前方。检查者调整物镜位置，使激光光束位于受检者右眼角膜顶点。按照Patel等[2]报道的方法，嘱受试者左眼注视以“米”字方式移动的视标，使用“section”模式采集中央约2 mm范围内的角膜上皮基底神经丛图像。然后缓慢向外上方移动视标，嘱受试者左眼跟随视标移动，LSCM观察右眼角膜上皮基底神经丛形态。观察到涡状结构后，再以涡状结构地理中心处的视标位置为中心，以“米”字方式移动视标，采集涡状区约2 mm范围内的角膜上皮基底神经丛图像。

1.2.2 图像处理与分析两名操作者各自负责自己所拍摄图像的处理与分析。每一受检眼采集300～400张清晰的图像，用Adobe Photoshop图像处理软件分别将涡状区和中央区的单张图像进行拼接，合成广域的神经形态图；再在每个部位的形态图上裁剪700 μm×700 μm大小的图片用于分析。其中涡状区要求以其地理中心为中心进行裁剪；中央区要求以图像中心为中心进行裁剪。然后在Image J图像分析软件中打开裁剪图，使用Neuron J插件进行定量分析，得出神经纤维总长。再将所得数据根据图像大小与像素的转换单位换算出单位面积的神经纤维长度(nerve fiber length，NFL)(mm·mm-2)。最后根据NFL值分别计算涡状区和中央区的观察者内和观察者间一致性，用于比较LSCM对二者检测的一致性。

1.3 统计学分析采用Medcalc统计学软件对数据进行分析。NFL以均数±标准差的形式表示。所有数据经Kolmogrov-Smirnov正态性检验。使用Bland-Altman分析和重复性系数(coefficient of repeatability，CoR)评估重复测量的一致性。Bland-Altman分析是一种图示和数值相结合的一致性评价方法，首先通过计算两次检查结果的差值和均值，绘制差值对应于均值的散点图，再通过差值的均数±1.96标准差来确定95%一致性区间(limit of agreement，LOA)。组间差值越接近于0，95%LOA越窄，说明一致性越好；CoR则定义为两次检查差值的标准差除以两次检查均值的均数，用百分数的形式表达。CoR低于10%被认为具有很高的重复性，CoR低于5%则被认为具有极高的重复性[3]。检验水准：α=0.05。

2 结果

所有受检眼均可于角膜中央偏鼻下方查见涡状结构，该区域水平方向延伸(984.00±162.91)μm，垂直方向延伸(683.52±122.98)μm。涡状结构表现为顺时针和逆时针2种形态，其中29眼为顺时针方向，1眼为逆时针方向。重复检查获得的涡状区图像显示角膜神经形态稳定，中央区图像显示角膜神经形态变异较大。见图1。

图1 涡状区与中央区LSCM图像 A:操作者A第1次检查涡状区图像；B:操作者B第1次检查涡状区图像；C:操作者A第2次检查涡状区图像；D:操作者A第1次检查中央区图像；E:操作者B第1次检查中央区图像；F:操作者A第2次检查中央区图像。观察范围均为700 μm×700 μm

操作者A第1次检查涡状区NFL为(26.44±4.86)mm·mm-2，第2次检查为(25.97±4.80)mm·mm-2，操作者B第1次检查为(26.70±4.89)mm·mm-2；操作者A第1次检查中央区NFL为(13.95±4.86)mm·mm-2，第2次检查为(14.37±5.05)mm·mm-2，操作者B第1次检查为(12.21±4.43)mm·mm-2。两个部位重复测量一致性参数见表1。涡状区一致性分析观察者内CoR值为6.6%，观察者间CoR值为6.1%，一致性很高；而中央区一致性分析观察者内CoR值为44.1%，观察者间CoR值为31.8%，一致性较差。

两个部位重复测量Bland-Altman分析结果详见图2。涡状区观察者内和观察者间测量差值均聚集于“0”刻度线附近，且95%LOA较窄，均在平均NFL的1个标准差的区间内，一致性良好；中央区观察者内和观察者间测量差值分布较分散，95%LOA较宽，为两次检查平均NFL标准差的2～3倍，一致性较差。

表1 涡状区与中央区NFL重复测量一致性参数

一致性参数涡状区AV1-AV2AV1-BV1中央区AV1-AV2AV1-BV1两次检查NFL差值的均数/mm·mm-20.47-0.26-0.421.74两次检查NFL差值的标准差/mm·mm-21.731.626.244.16两次检查NFL均值的均数/mm·mm-226.2126.5714.1613.08两次检查NFL均值的标准差/mm·mm-24.814.754.163.85Bland-Altman 95%LOA/mm·mm-2-2.92～3.86-3.43～2.91-12.66～11.82-6.41～9.88CoR6.6%6.1%44.1%31.8%

注：AV1：操作者A第1次检查；BV1：操作者B第1次检查；AV2：操作者A第2次检查

图2 重复测量Bland-Altman散点图 A:同一操作者不同时间涡状区NFL值Bland-Altman散点图；B:同一操作者不同时间中央区NFL值Bland-Altman散点图；C:不同操作者同一时间涡状区NFL值Bland-Altman散点图；D:不同操作者同一时间中央区NFL值Bland-Altman散点图。蓝色实线表示两次测量差值的均数，橙色虚线表示“0”刻度线，暗红色虚线表示95%LOA的上限和下限。AV1：操作者A第1次检查结果；BV1：操作者B第1次检查结果；AV2：操作者A第2次检查结果

3 讨论

角膜上皮基底神经丛走行于角膜上皮基底细胞与前弹力层之间，是角膜神经分布最为致密的部位[4]。由于其厚度均一，走行平直，比较容易成像；因此，也是研究最多的角膜神经结构[5]。LSCM作为一种无创性的检查目前已被广泛应用于观察角膜上皮基底神经丛。研究发现多种疾病可以引起角膜上皮基底神经丛改变，如干眼、圆锥角膜、青光眼、糖尿病等[6]。随着研究的不断深入，越来越多的学者应用LSCM对角膜上皮基底神经丛进行定量分析，主要的观察指标包括神经纤维密度、神经分支密度、NFL和神经纤维弯曲度。其中，NFL的变异性最小，可靠性最好[7-8]。因此，本研究选择NFL作为测量指标。以往的研究通常选择角膜中央区对角膜上皮基底神经丛进行分析，但是，由于不同位置角膜上皮基底神经丛的形态及密度不同[9]，且LSCM观察视野小、缺乏定位功能，不能保证对同一位置进行重复测量，使得不同患者或同一患者不同时间采集的图像变异较大，无法进行比较[10]。因此，亟需挑选合理的检查部位或查找目标，提高设备参数的可靠性与可重复性。

Patel等[2]在2005年首次发现角膜上皮基底神经丛呈放射状向中央聚集，最终在角膜顶点鼻下方 1～2 mm处聚集形成一个旋涡状集合，称为涡状结构。此后，又有多项研究先后验证了涡状结构的存在[11-14]。我们的研究也证实，涡状结构在健康人角膜上皮基底神经丛中普遍存在。其旋涡形态表现为顺时针和逆时针两种方向，且以顺时针方向多见(96.7%)。本研究受试者涡状区水平方向延伸(984.00±162.91)μm，垂直方向延伸(683.52±122.98)μm，这与相关文献报道结果基本一致[2，14]。

由于涡状结构形态特殊，位置固定，可能成为角膜上皮基底神经丛定量评估的理想区域。Utsunomiya等[15]针对糖尿病患者的研究也显示，涡状区NFL值较中央区变异小，能更精确地反映糖尿病角膜神经损伤的程度。但是，也有研究认为，涡状区与中央区的NFL在评估糖尿病周围神经病变严重程度方面具有相同的效力[16]。为了评估LSCM对涡状结构检测的一致性,明确涡状区在角膜上皮基底神经丛定量评估中的应用价值，本研究对比了涡状区和中央区NFL在LSCM重复检查中的一致性。由于LSCM单张图像的观察视野只有400 μm×400 μm，不能代表整体的情况[17-18],本研究同时引入图像合成技术，将单张图片拼接形成广域的神经形态图，再根据涡状区的延伸范围，选择以涡状结构为中心的700 μm×700 μm大小的图像进行分析，从而最大限度地减少了测量误差。

我们首先对在同一操作者不同时间(间隔1周)采集的涡状区和中央区角膜上皮基底神经丛图像进行分析，比较观察者内的一致性。结果显示，涡状区CoR值为6.6%，Bland-Altman散点图两次检查差值分布集中于“0”刻度线附近，且95%LOA较窄(在平均NFL的1个标准差的区间内)，表明其一致性良好；而中央区CoR值为44.1%，Bland-Altman散点图两次检查差值分布较分散，95%LOA较宽(约为平均NFL标准差的3倍)，表明其重复测量波动较大，一致性较差。同样,在不同操作者同一时间采集的图像分析中(观察者间一致性)也显示，涡状区一致性指标良好(CoR值为6.1%，Bland-Altman 95%LOA较窄，在平均NFL的1个标准差的区间内)；而中央区一致性指标较差(CoR值为31.8%，Bland-Altman 95%LOA较宽，约为平均NFL标准差的2倍)。由此可见，涡状区重复测量指标一致性好，具有良好的再现性；而中央区指标重复性差，测量参数容易出现较大的变异，结果可靠性差，无法用于角膜上皮基底神经丛重复测量的定量分析。

综上所述，本研究利用LSCM对健康志愿者角膜上皮基底神经丛进行观察，发现涡状结构普遍存在，且位置固定，形态易于辨认，因此能够作为重复检查的定位标志，从而大大提高LSCM的定位功能。同时，通过系统比较涡状区和中央区重复测量的一致性，证明涡状区图像再现性良好，可以推广应用于角膜上皮基底神经丛的定量分析，尤其适用于疾病疗效评价和随访等纵向研究，可显著提高LSCM的临床指导价值。