云南省婴儿期不同民族高非结合性胆红素血症UGT1A1基因多态性研究

奎莉越 王明英 周百灵 李莉 贺晓莉 世淑兰 沈茹

非结合型胆红素血症包括Gilbert 综合征（Gilbert syndrome，GS）和Crigler-Najjiar 综合征（Crigler-Najjar syndrome，CNS）等，是由于编码胆红素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（Uridine diphosphateglucuronosyl transferase，UGTs）的UGT1A1基因发生突变或变异，导致酶活性部分或完全丧失，造成胆红素升高[1-2]。患儿多在新生期出现黄疸，也可在婴儿期即发生肝硬化、肝衰竭，胆红素脑病等后遗症，重者出生数天或数周死亡，严重危害婴儿的健康[3-4]。国内外的研究已发现该病有明显的遗传异质性，已发现有40多个UGT1A1基因突变与该病相关，并且突变谱存在明显的地区和人群差异[5-8]。云南人群中UGT1A1基因突变谱目前还不清楚，导致该病的诊断、治疗和遗传咨询困难。虽然国内有UGT1A1基因的相关研究，但不同民族中可能有不同的突变类型分布，且长期工作经验发现一些病例尚不能用已知的突变类型解释[9]。本文将探讨UGT1A1基因突变与云南儿童GS和CNS 的关系，为临床诊断、治疗、遗传咨询提供参考，报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象

收集怒江、保山、临沧、迪庆云南边界地区2018年1月至2019年11月就诊于本院新生儿科及消化内科门诊确诊的GS和CNS 患儿67例（观察组，基因检测均阳性），并选取同期健康体检婴儿67例作为对照组。纳入标准：①生长发育良好；②新生儿期黄疸至1月未完全消退；③肝功能检查结果为高非结合胆红素血症，即总胆红素＞17.1 μmol/L，非结合胆红素所占比值大于80%，经低热量试验、苯巴比妥试验、基因检测和（或）肝穿刺病理组织学检查符合GS 或CNS；④均无亲缘关系。排除标准：①急慢性肝炎患儿；②结合胆红素（Conjugated bilirubin，CB）＞非结合胆红素（Unconjugated bilirubin，UCB）者；③贫血、未做网织红细胞（Reticulocytes，Ret）或Ret＞5%者；④谷草转氨酶（Aspartate transaminase，AST）、丙转氨酶（Alanine transaminase，ALT）异常者；⑤出生窒息者；⑥早产儿（＜37 W）或出生低体重儿（＜2 500 g）。本研究经本院伦理委员会审核通过，患儿家属均对本研究知情，自愿签署知情同意书。

1.2 资料收集

记录患儿的性别、年龄、民族、喂养史、肝功能情况，常规体检及血常规、Ret 计数等。

1.3 基因突变检测

抽取受试者静脉血2 mL，采用外周血样本DNA 提取，采用PCR 方法获取UGT1A1基因，针对exon1、exon2、exon3、exon4、exon5 五个目的基因区段进行PCR 扩增和DNA 直接测序，确定基因突变和变异；分析氨基酸的改变。①样本DNA 提取：严格按血液基因组DNA 抽提试剂盒操作提取基因组DNA；②引物的设计，见表1；③PCR 扩增体系：扩增反应总体积为20 μL，6×Buffer 缓冲液5 μL，Taq 酶（5 U/L）1 μL，dNTP 5 μL，引物各2 μL，模板5 μL，加无菌去离子水至25 μL；反应条件94℃30 s，58℃30 s，72℃40 s，循环35次；72℃10 min；④PCR 产物纯化后在用AB-3500型测序仪进行直接测序；⑤测序图采用BioEdit 基因阅读软件读图并人工核对，和基因库中的标准序列NG_009254.1和已报道的SNP位点进行比对，初步判定变异位点，对变异所在的序列重复PCR 并反向测序加以证实；⑥测序结果用Chromos 基因阅读软件判断，用Mutation Surveyor4.0 软件分析突变位点，用HGMD 数据库查询。

1.4 观察指标

①对比两组临床资料。②比较两组UGT1A1基因突变位点基因型与等位基因频率分布。③分析UGT1A1基因突变与非溶血性非结合型高胆红素血症的相关性。④比较分析性别、民族与UGT1A1基因变异谱的关系。

表1 引物设计Table1 Primer design

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计进行数据处理，计量资料以（）表示、两组间比较t检验，计数资料用n（%）表示、行χ2检验，采用Spearman 进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组年龄、胎龄、出生体重、性别、血红蛋白、白细胞计数、喂养方式、民族、C反应蛋白等资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。具有可比性。见表2。

表2 两组临床资料比较Table2 Comparison of clinical data between the 2 groups

2.2 两组UGT1A1基因突变位点基因型与等位基因频率分布比较

行UGTlAl全外显子测序、HGMD 数据库查询和Alamut 功能软件预测，发现3个与非结合性高胆红素血症致病相关的突变位点，分别是：1 号外显子c.211G＞A；5 号外显子c.1456T＞G；3 号外显子c.1061C＞T；两组突变位点基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05），具有人群代表性；观察组c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T位点突变率高于对照组（P＜0.05），组间基因型频率和等位基因频率比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 UGT1A1基因突变位点基因型与等位基因频率分布[n（%）]Table3 Genotype and allele frequency distribution of UGT1A1 mutation site[n（%）]

2.3 UGT1A1基因突变与非溶血性非结合型高胆红素血症的相关性分析

采用Spearman 进行相关性分析，c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T 杂合与纯合突变均与非溶血性非结合型高胆红素血症呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 UGT1A1基因突变与非溶血性非结合型高胆红素血症的相关性Table4 Correlation between UGT1A1 gene mutation and non-hemolytic non-binding hyperbilirubinemia

2.4 性别、民族与UGT1A1基因变异谱的关系比较

不同性别、不同民族患儿UGT1A1基因各位点基因型分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；汉族患儿c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T 杂合突变型均高于少数民族患儿，汉族患儿c.1456T＞G 纯合突变型频率低于少数民族患儿（P＜0.05）。见表5。

表5 性别、民族与UGT1A1基因变异谱的关系比较[n（%）]Table5 Comparative analysis of the relationship between gender，ethnicity，and UGT1A1 gene mutation profile[n（%）]

3 讨论

GS为遗传性非溶血性黄疸中常见的疾病，常被误诊为肝炎等疾病；CNS-II 表现为中重度胆红素血症，其胆红素水平可在苯巴比妥治疗后恢复正常或下降，但黄疸长期持续存在并持续加重，进而发生肝硬化、肝功能衰竭；CNS-I为致死性疾病，CNS-I 患儿常在出生后数天到数周内死于胆红素性脑病[10-11]。

陈伟等[12]报道发现，不明原因非结合性高胆红素血症足月新生儿c.211G＞A 突变占比高于生理性黄疸或健康足月新生儿。本研究结果提示UGT1A1基因c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T位点突变可能是GS、CNS 发病的原因。UGT1A1是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGT）1家族中第一外显子，对UGT 的活性起决定性作用，UGT1A1基因所编码的产物为胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（bilirubin UDP glucumnosyltrasferase，B-UGT），可促进非结合胆红素转变为结合胆红素[13-15]。当UGT1A1基因突变，如UGT1A1第1外显子211位G＞A 杂合突变，导致所编码的第71位甘氨酸（Gly）变为精氨酸（Arg）；UGT1A1第5 号外显子1456位T＞G 杂合突变，导致了酪氨酸（Tyr）变为天门冬氨酸（Asp）等，均可使B-UGT 活性降低或缺陷，非结合胆红素葡萄糖醛酸化障碍，不能排出体外，从而造成体内非结合胆红素升高，故与GS、CNS有关[16-18]。且本研究进一步分析发现，c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T 杂合与纯合突变均与非溶血性非结合型高胆红素血症呈正相关，进一步佐证了以上各位点突变与GS、CNS 发病有关，这可为临床诊断GS、CNS 及从遗传水平进一步阐述GS、CNS 发病原因提供循证参考。

不同性别患儿UGT1A1基因各位点基因型分布比较相似，说明性别与UGT1A1基因突变无明显的关系。Abudahab S 等[19]报道显示，提示UGT1A1基因突变在不同民族中可能有不同的突变类型分布。目前国内关于UGT1A1基因突变在不同民族中的报道鲜见，本研究对此探讨结果提示UGT1A1基因c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T复合杂合突变致病主要集中在汉族人群中，c.1456T＞G 纯合突变集中体现在少数民族中，具有种族异质性，临床可据此有选择性的进行基因检测，以快速明确不明原因非结合性高胆红素血症的原因，为针对性的干预提供参考，但造成种族间差异的详细机制不清楚，仍有待后续的探讨。本研究不足之处在于，云南怒江、保山等地区包括白族、哈尼族等较多少数民族种类，文中统一将其归为少数民族，尚未阐明具体各个少数民族UGT1A1基因突变谱，且病例数较少是另一不足，需后续扩大样本量进行深入的探究。

综上所述，云南地区婴儿期高非结合性胆红素血症发病与UGT1A1基因c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T位点突变有关，c.1456T＞G 纯合突变集中体现在少数民族中，c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T复合杂合突变致病主要集中在汉族人群。