结肠癌血清IGF-1水平及肿瘤组织中VEGF-C、VEGFR-3表达与淋巴结转移的相关性研究

杨秀成 于琼 巩林强 杨艳★

结肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一，发病率仅次于肺癌和乳腺癌，其发生原因与饮食、环境、种族、遗传等多种因素有关[1]。血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是VEGF家族中的成员之一，血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor3，VEGFR-3）是酪氨酸激酶家族成员之一，胚胎发育早期在心血管系统中表达，成年之后，仅在淋巴内皮上表达[2]，而在结直肠正常组织中检测不到表达[3]。胰岛素生长因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1）是一种具有细胞增殖调控作用的低分子多肽，在多种恶性肿瘤中呈高表达状态，并参与肿瘤细胞的增殖、转移过程[4]。本研究通过检测结肠癌患者血清IGF-1水平及肿瘤组织中VEGF-C、VEGFR-3表达情况，分析三者间关系，以期为结肠癌患者预后提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本收集

血清样本和组织标本均来自于2016年5月至2017年7月本院接受手术治疗的60例结肠癌患者和60例结肠腺瘤患者，分别作为结肠癌组和结肠腺瘤组，同一结肠癌组织标本癌旁正常组织作为癌旁正常组。结肠癌和癌旁正常组中，男36例，女24例，年龄46～77岁，平均（61.22±7.68）岁；结肠腺瘤组中，男33例，女27例，年龄45～75岁，平均（62.18±6.25）岁。另选取60例体检健康者作为健康组，其中男性35例，女性25例，年龄44～78岁，平均（61.82±7.36）岁，3组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。健康组收集血清作为对照，血清样本贮存于-80°冰箱备用。结肠癌组、结肠腺瘤组、癌旁正常组的组织标本采用福尔马林固定，石蜡包埋后备用。本实验经本院伦理委员会批准同意，所有患者均签署知情同意书。

结肠癌组纳入标准：①经肠镜活检或手术检查确诊；②符合《常见消化系肿瘤诊治学》[5]中结肠癌诊断标准。排除标准：①术前接受相关治疗；②肛管癌、结直肠多发性息肉者；③有手术禁忌证者；④处于妊娠期或哺乳期者。

结肠腺瘤组纳入标准：①均采用手术切除治疗；②符合《常见消化系肿瘤诊治学》[5]中结肠腺瘤诊断标准。排除标准；①合并肾功能障碍、陈旧性心肌梗死、冠心病者；②严重溃疡性结肠炎者；③伴有肠内容物潴留者；④处于妊娠期或哺乳期者。

1.2 主要试剂

兔抗人VEGF-C多克隆抗体（E-AB-33567）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；兔抗人VEGFR-3多克隆抗体（bs-1083R-1）购自上海恒斐生物科技有限公司；鼠抗人D2-40 单克隆抗体（ZM-0465）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；即用型快捷免疫组化MaxVision TM 试剂盒（KIT-5002）购自福州迈新生物技术开发有限公司；二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒（ZLI-9019-10ML）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；IGF-1 酶联免疫吸附试剂盒（XNDW36）购自上海旭年生物科技有限公司。

1.3 IGF-1 检测方法

采集受试者清晨空腹静脉血5 mL，获取血清，根据酶联免疫吸附试剂盒说明书步骤检测血清IGF-1水平。

1.4 免疫组化方法

石蜡连续切片，厚度控制在4～5 μm 作用，采用3%过氧化氢处理10 min 左右，将内源性过氧化物酶阻断。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗干净后，热修复15 min。PBS 冲洗3次，一抗4℃封闭过夜，PBS 冲洗干净后，二抗常温下孵育20 min。然后PBS 充分冲洗，二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）显色后采用苏木素复染。最后脱水、透明、封片，进行镜检。

结果判定[6]：在肿瘤区选取5个视野，根据阳性细胞所占比例评分，低于5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%之间为2分，51%～75%为3分，75%以上为4 分；根据染色强度评分，不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3 分。通过两者乘积判断结果，即0～4 分为阴性，5 分以上为阳性。

1.5 微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density，LMVD）的判定

D2-40 阳性产物表达于淋巴管内皮细胞胞浆及细胞膜，按照Weidner 法计算LMVD，先于低倍镜下选取热点，然后调整至200倍镜，选取4个视野计算微淋巴管总数，LMVD值取其均值[7]。

1.6 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行分析，计量数据用（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析计数资料用%表示，行χ2检验，多组之间两两比较采用卡方分割比较。相关性分析采用Spearman 等级相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清IGF-1水平比较

3组间血清IGF-1水平比较，结肠癌组血清IGF-1水平显著高于结肠腺瘤组和健康组差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组血清IGF-1水平比较[（±s）]Table1 Comparison of serum IGF-1 level in each group[（±s）]

表1 各组血清IGF-1水平比较[（±s）]Table1 Comparison of serum IGF-1 level in each group[（±s）]

注：结肠癌组与健康组比较，q=24.829，aP=0.000，结肠癌组与结肠腺瘤组比较，q=7.919，bP=0.000。

组别结肠癌组结肠腺瘤组健康组F 值P 值n 60 60 60 IGF-1（ng/mL）145.83±18.32ab 123.27±12.30 82.52±7.38 49.538 0.000

2.2 各组VEGF-C和VEGFR-3表达情况比较

结肠癌组的细胞胞质中可见棕黄色染色颗粒，VEGF-C和VEGFR-3表达呈阳性，见图1A，图1B。3组间VEGF-C和VEGFR-3 阳性表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），结肠癌组VEGF-C和VEGFR-3 阳性表达率明显高于结肠腺瘤组和癌旁组（P＜0.05）。见表2。

图1 结肠癌肿瘤组织中VEGF-C和VEGFR-3 呈阳性表达（SP 法，200×）Figure1 Positive expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in colon cancer tumor tissues（SP 法，200×）

表2 各组VEGF-C和VEGFR-3表达情况比较[n（%）]Table2 Comparison of expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in each group[n（%）]

2.3 结肠癌组血清IGF-1水平、组织VEGF-C和VEGFR-3表达与病理特征关系

结肠癌患者血清IGF-1水平与肿瘤直径、分化程度、浸润程度和淋巴结转移有关，结肠癌肿瘤组织VEGF-C 阳性表达与分化程度、浸润程度和淋巴结转移有关，结肠癌肿瘤组织VEGFR-3 阳性表达与浸润程度和淋巴结转移有关差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.4 LMVD值与结肠癌病理特征关系

淋巴管在肿瘤组织中分布不均，肿瘤边缘区域的LMVD 明显高于肿瘤内部区域，且边缘区域淋巴管形态不一，多呈扩张状态，而内部区域淋巴管多表现为无腔、条索状，为无功能型。结肠癌组LMVD值为（3.86±1.14），结肠腺瘤组LMVD值为（1.45±0.41），癌旁组LMVD值为（0.76±0.16），结肠癌组LMVD值明显高于结肠腺瘤组和癌旁组（q1=15.409，q2=20.859，P＜0.05）。LMVD值与结肠癌浸润程度和淋巴结转移有关（P＜0.05），见表4。

表3 结肠癌组血清IGF-1水平、组织VEGF-C和VEGFR-3表达与病理特征关系[（n（%），（±s）]Table3 Relationship between serum IGF-1 level，expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in tissues and pathological features in colon cancer group[（n（%），（±s）]

表3 结肠癌组血清IGF-1水平、组织VEGF-C和VEGFR-3表达与病理特征关系[（n（%），（±s）]Table3 Relationship between serum IGF-1 level，expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in tissues and pathological features in colon cancer group[（n（%），（±s）]

病理特征性别年龄（岁）肿瘤直径（cm）分化程度浸润程度淋巴结转移男女＜60≥60＜5≥5高、中分化低分化T1-T2 T3-T4有无n 36 24 15 45 23 37 49 11 41 19 37 23 IGF-1（ng/mL）147.28±15.84 143.93±14.05 144.28±13.04 146.63±16.22 139.54±14.89 156.32±16.21 136.93±17.66 155.52±13.47 132.05±17.34 156.20±13.94 158.73±15.96 133.29±14.31 P 值0.405 0.508 0.000 0.002 0.000 0.000 VEGF-C 阳性23（63.89）14（58.33）9（60.00）28（62.22）13（56.52）24（64.86）27（55.10）10（90.01）21（51.22）16（84.21）28（75.68）9（39.13）P 值0.665 0.878 0.518 0.027 0.014 0.005 VEGFR-3 阳性22（61.11）13（54.17）9（60.00）26（57.78）11（47.83）24（64.86）27（55.10）8（72.72）20（48.78）15（78.95）26（70.27）9（39.13）P 值0.593 0.880 0.193 0.284 0.027 0.017

表4 LMVD值与结肠癌病理特征关系Table4 Relationship between LMVD value and pathological features of colon cancer

2.5 血清IGF-1与组织VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 的相关性分析

IGF-1与VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 均呈正相关（r=0.68，r=0.66，r=0.55，P＜0.05），VEGF-C和VEGFR-3与LMVD 均呈正相关（r=0.60，r=0.62，P＜0.05）。

3 讨论

随着饮食结构和生活习惯的改变，结肠癌发病率呈逐年上升趋势，我国新发病例约为1.3万[8]。手术治疗是结肠癌的主要治疗方法，并辅以免疫、化疗、中药等综合治疗方案。治疗后1～3年内，许多患者会出现肿瘤转移或复发，而肿瘤的转移和复发与肿瘤侵袭、转移密切相关[9]。许多研究证实微血管的形成可促进肿瘤侵袭、转移[10]，但关于微淋巴管形成对肿瘤发生发展的影响尚需进一步探究。

IGF-1 是主要由肝脏合成的具有细胞增殖和凋亡调控作用的多肽类生长因子，动物实验表明，IGF-1 基因缺失的结直肠癌小鼠与对照组小鼠相比，肿瘤生长缓慢，发病率明显降低，说明IGF-1 在肿瘤的发生过程中起到促进作用[11]。本研究结果显示与田晓慧等人[12]研究结果一致。分析原因可能是IGF-1 通过与其受体结合激活酪氨酸酶活性，启动PI3K/AKT和MAPK 信号通路，进而促进癌细胞增殖分化，抑制癌细胞凋亡[13]。本研究进一步分析结果显示，肿瘤直径≥5 cm、低分化、浸润程度深、有淋巴结转移的血清IGF-1水平明显较高，说明较高血清水平的IGF-1 可促进肿瘤生长、浸润与淋巴结转移。

在淋巴管生成和淋巴结转移研究中，VEGF-C和VEGFR-3为热门研究因子。本研究发现VEGFC和VEGFR-3 在结肠癌肿瘤组织中均表达上调，且浸润程度较深和伴有淋巴结转移的患者VEGF-C和VEGFR-3 阳性率均明显高于浸润程度浅、无淋巴结转移患者，提示VEGF-C和VEGFR-3可促进结肠癌的侵袭和转移过程，与在食管癌[14]、胃癌[15]等研究中结果一致。

本研究发现，结肠癌组LMVD值明显高于结肠腺癌组，且浸润程度深、伴有淋巴结转移组织中LMVD值较浸润程度浅和无淋巴结转移组织中LMVD值较高，提示LMVD值与结肠癌淋巴结转移密切相关。因为肿瘤边缘区域淋巴管管壁基底膜不连续，肿瘤细胞易进入新生淋巴管，有利于肿瘤细胞的淋巴结转移[16]。张泽进等人[17]相关研究显示，结肠癌组织VEGFR-C、VEGFR-3与LMVD呈正相关，本研究与上述研究结果一致。IGF-1与淋巴结转移有关，但是否与LMVD 及VEGF-C和VEGFR-3表达存在一定联系，国内尚未见相关文献报道。本研究结果显示，IGF-1与VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 均呈正相关，推测可能与IGF-1通过与其受体结合激活PI3-K 信号通路，诱导VEGF-C 表达上调有关，而VEGF-C 作为淋巴生成的关键因素，可激活VEGFR-3 以及后续一系列信号传导通路，促进淋巴管内皮增殖，在肿瘤边缘区域形成新生微淋巴管，提高淋巴结转移发生率[18-19]。

综上所述，结肠癌血清IGF-1水平以及组织中VEGF-C和VEGFR-3表达均明显升高，高血清水平的IGF-1和VEGF-C和VEGFR-3 的阳性表达与结肠癌淋巴转移密切相关，所以结肠癌血清IGF-1水平的检测可在术前一定程度评估结肠癌恶化程度，且血清学检测操作简单方便，可能可作为预测肿瘤发生发展的新的生物标志物。另外IGF-1、VEGF-C和VEGFR-3 互呈正相关，共同促进微淋巴管形成，阻断IGF-1水平的升高可能成为减少VEGF-C和VEGFR-3表达，抑制结肠癌发展的新途径。