固态发酵产香菌株筛选分析研究

胡腾飞，焦凯旋，黄启蒙，吴时玺，侯宁宁，李 萌，马 林

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450001；2.浙江中烟工业有限责任公司技术中心，浙江杭州 310004）

微生物发酵可有效降解烟草中的大分子，通常这些大分子对烟草的抽吸品质是不利的[1-2]。近年来，随着微生物技术的发展，更多学者重视对烟草有益微生物的筛选和应用研究，利用有益微生物对烟草进行发酵。微生物发酵产香是获取天然香料的较好方法[3]，郭林青等人[4]从巨峰葡萄表皮分离筛选得到一株能够使烟末发酵液产生明显花香韵和甜香韵的酵母菌株YG-4，对烟末进行发酵来改变其特征香味，以期为后续进行配方香料优化提供帮助和依据。刘丽芬等人[5]从香茅草中分离出菌株XCJ-1，其发酵液具有清甜香和花香，制成生物香料进行烟草加香，评吸发现具有增加烟香、降低刺激性、改善烟气质等作用。但利用有益菌株对难以直接应用于配方的烟叶进行发酵的研究相对较少，在基本不降低烟草物理特性的基础上，通过人工固态发酵改善烟叶品质。

以实验室液态发酵较好的3株产香菌株为试验菌株，通过微生物固态发酵，研究3株产香菌固态发酵对烟叶的增香作用，通过对烟叶香气总量和对烟叶进行的感官评吸结果，综合筛选出能够在固态发酵中对烟草增香提质的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

平顶山上部烟叶，河南中烟技术中心提供。

芽孢杆菌（Bacillus pumilus strain）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、汉逊酵母（Hanseniaspora.sp），课题组分离并保存。

葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠，无水硫酸钾纯度均为AR，天津市大茂化学试剂厂提供；色谱级二氯甲烷，山东禹王和天下新材料有限公司提供；HP6890/5976型GC/MS气质联用仪，美国安捷伦公司产品；滚筒式固态发酵反应舱，郑州轻工业大学烟草生物技术课题组共同研制完成。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的组成及配制

（1） 芽孢杆菌培养基。酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉20 g/L，pH值自然，置于高压蒸汽灭菌锅中，于121℃下灭菌30 min，储存于超净工作台中备用。

（2） 酵母培养基。酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，pH值自然，置于高压蒸汽灭菌锅中，于115℃下灭菌30 min，储存于超净工作台中备用。

1.2.2 烟叶发酵

取适量的平顶山烟叶放入固态发酵反应舱中，将生长为对数期的菌液以15%的接菌量均匀喷至烟叶表面（以干烟叶质量计），补充水分至烟叶初始含水率为35%，调节发酵舱的温湿度，使整个发酵过程烟叶含水率保持在35%，发酵温度31℃，发酵舱转速4 r/min，发酵时长24 h。

1.2.3 烟叶发酵致香成分分析

表1 发酵烟叶致香成分分析

准确称取15 g制备的待测样品，萃取剂为二氯甲烷，在60℃下进行2.5 h的蒸馏萃取。然后进行水浴浓缩，加入1 mL的乙酸苯乙酯（0.726 4 mg/mL）作为内标，浓缩蒸发至1 mL，过0.22 μm滤膜于2.0 mL的色谱瓶中，随后立即进行GC/MS气相色谱-质谱联用仪分析。

（1） GC条件。色谱柱HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），进样口温度280℃，载气He，溶剂延迟5 min，进样量1 μL，分流比15∶1，程序升温为初始温度50℃，6℃/min升至280℃保持10 min。

（2） GC/MS条件。采用MSD检测器，其他GC条件同上；载气He，传输线温度280℃，EI电子能源70 eV，倍增器电压1 450 V，质量扫描范围为全扫描，离子源温度230℃，四极杆温度150℃。

2 结果与分析

2.1 致香成分分析

发酵烟叶致香成分分析见表1，发酵后烟叶各组分致香总量分析见表2，各组分致香成分总量见图1。

表2 发酵后烟叶各组分致香总量分析

由表1可以得出，从致香成分总量来看，利用3株产香菌固态发酵后烟叶的致香成分与对照组相比均有不同程度的增加，菌株固态发酵产香能力依次为汉逊酵母＞酿酒酵母＞芽孢杆菌，其中经汉逊酵母发酵的烟叶致香成分总量最高且达到149.99 μg/g，芽孢杆菌发酵的烟叶的致香成分总量最低为110.30 μg/g；从致香成分上看，成分变化不大，主要体现在单个成分含量上发生变化。

由表2和图1可以得出，在4组处理中，致香成分中酮类占香气总量的78.2%～88.6%，在香气成分中占较大比例，酮类本身具有较强的香气贡献，是烟草和烟气中中性致香成分的最主要组成[6]，酮类组分汉逊酵母＞酿酒酵母＞对照＞芽孢杆菌；醛类和酯类组分，酿酒酵母组多于对照组，主要是糠醛、苯乙醛、二氢猕猴桃内酯、5-甲基糠醛，这些都是烟草中重要的香气成分。

2.2 不同产香菌株致香成分总量显著性分析

为筛选出烟草固态发酵产香较好的菌株，分别选用3株产香菌株进行固态发酵试验，每个试验重复3次，判断不同菌株发酵对致香成分总量是否具有显著影响。

不同处理对致香成分总量影响的方差分析见表3，不同处理下的致香成分见表4。

表3 不同处理对致香成分总量影响的方差分析

由表3可以得出，在进行固态发酵产香菌株筛选试验中，不同处理间即3组试验组与对照组中组间显示极显著差异，每组试验重复3次，各组间显示差异不显著，即不同处理对烟叶致香成分的影响极显著。

由表4可以得出，对照组致香成分为108.72±1.76 μg/g，芽孢杆菌组致香成分为 110.30±2.85 μg/g，汉逊酵母组致香成分为149.99±2.86 μg/g，酿酒酵母组致香成分为128.08±2.30 μg/g；对照组与芽孢杆菌组的烟叶在致香成分上存在差异不显著，与汉逊酵母组和酿酒酵母组的烟叶在致香成分上存在差异极显著，芽孢杆菌组与对照组烟叶在致香成分上差异不显著，与汉逊酵母组和酿酒酵母组存在差异极显著，汉逊酵母与对照组、芽孢杆菌组和酿酒酵母组烟叶在致香成分上均存在差异极显著，酿酒酵母组与对照组、芽孢杆菌组和汉逊酵母组烟叶在致香成分上均存在差异极显著。

表4 不同处理下的致香成分/μg·g-1

2.3 感官品质评价

将对照烟叶和发酵后的烟叶卷制，以边评吸边交流的方式进行评分。

感官评吸见表5。

表5 感官评吸/分

由表5可以得出，芽孢杆菌发酵后的烟叶，评吸结果与对照组相比分值略有下降，杂气略大，燃烧性差；酿酒酵母发酵后的烟叶，评吸结果在香气量上分值有所提升，杂气略大，对改善对照组的香气量是有显著作用；汉逊酵母发酵后的烟叶，评吸结果在香气质、香气量分值均有所提高，刺激性也有所降低，对改善烟叶感官品质有显著作用。

3 结论

选取3株液态发酵较好的产香菌株，利用3株产香菌株分别进行人工固态发酵，通过气相色谱-质谱联用仪分析发酵后烟叶的致香成分，并通过感官评吸，综合得出汉逊酵母和酿酒酵母在固态发酵条件下对烟叶的感官品质均具有改善作用，主要表现在香气量上有明显改善，其中汉逊酵母对香气量的改善最为明显，这与发酵后烟叶致香成分结果一致。

酵母[7-8]较多用于改善烟叶品质，龙章德等人[8]研究了不同酵母接种量对改善烟叶品质的影响，接种量可能直接影响了发酵后烟叶评吸杂气略大，同时培养基也可能增加卷烟评吸的刺激性，后期可通过减少接种量对产香菌人工固态发酵改善烟叶品质进行优化。