大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系制备及固态基料开发

陆晓丹，钟榕斌，黄璐瑶，魏 微，陈丽娇，程文健，黄 群，梁 鹏，2

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.福建省海洋生物技术重点实验室，福建福州 350002）

大黄鱼（Pseudosciaena crocea） 作为我国重要的养殖经济鱼类之一，其主要生产繁殖基地位于福建宁德地区。根据《中国渔业统计年鉴》 （2019），大黄鱼海水养殖全国产量达19.80万t，其中16.54万t产自福建省，占比高达83.54%[1]。大黄鱼的主要加工副产物鱼卵常常被当作废弃物丢弃，造成污染环境和资源浪费的问题[2-4]。课题组前期发现，大黄鱼鱼卵中磷脂含量丰富，是ω-3多不饱和脂肪酸（PUFAs） 的重要来源，二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA） 占鱼卵中总脂肪的比例之和达25.5%[5]，能有效预防高血脂症等老年疾病，且DHA对大脑的发育也起着至关重要的作用[6-9]。大黄鱼鱼卵磷脂因富含ω-3 PUFAs而稳定性低，且略带腥味，使其在食品工业中的应用受到了很大程度的限制[10]。

大黄鱼鱼卵磷脂具有多种生理功能，是一类含磷酸的脂类[11]，由1个极性磷酸头部基团和1个或2个非极性脂肪酰基尾部基团构成[12]，因而具有优越的乳化性能。酪蛋白是牛奶中含量较高的优质蛋白质，其含有人体必需氨基酸，营养价值丰富。Beekwith A C[13]证实了磷脂-蛋白相互作用的存在；Van N W等人[14]认为磷脂与蛋白之间相互作用能达到协同促进乳液稳定的效果；Kasinos P M[15]也发现磷脂与牛奶中的蛋白质可以通过疏水相互作用力提高复合乳化体系的稳定性。喷雾干燥是目前食品工业应用最广泛的微胶囊化方法之一，可将液态的复合乳液进一步固化得到方便存储、运输、食用的粉末状产品，技术成熟，操作便捷[16-17]。

目前，关于植物磷脂的乳化性研究颇多，如大豆磷脂[18-19]、油菜磷脂[20]等，但是对大黄鱼鱼卵磷脂作为乳化剂与蛋白质复合的相关研究还未见报道。因此，为进一步提高大黄鱼鱼卵磷脂的综合开发利用水平，在单因素试验基础上，借助Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析，优化大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系的制备工艺条件，以期改善复合体系的乳化活性；还通过低温喷雾干燥获得大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白固态基料，并对感官等理化指标进行表征，借助扫描电子显微镜研究固态基料的微观结构，旨在丰富大黄鱼鱼卵磷脂的应用形式，为其应用于食品工业中提供理论依据，拓展大黄鱼加工副产物的利用途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大黄鱼鱼卵磷脂，实验室自制；酪蛋白，分析纯，购自中国国药试剂网；花生油，购自永辉超市。

WFZUV-2000型紫外-可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；FB-110型高压均质机，励途（上海） 机械设备工程有限公司产品；BS110S型赛多利斯电子天平，赛多利斯（北京）天平有限公司产品；DHG-9070A型恒温鼓风干燥箱，精宏（上海）实验设备有限公司产品；LUMiSizer65型全功能稳定性分析仪，德国LUM公司产品；Nova NanoSEM 230型扫描电子显微镜，捷克FEI Czech Republic s.r.o.公司产品；HJ-4A型磁力搅拌器，金坛宏华（江苏）仪器厂产品；YC-2000型低温喷雾干燥机，雅程（上海）仪器设备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合乳液的制备

参照王欢等人[21]的研究方法并稍作修改。首先，精确称取2.0 g鱼卵磷脂和4.0 g酪蛋白，分别置于80 mL和160 mL的磷酸盐缓冲液中，得到大黄鱼鱼卵磷脂溶液和酪蛋白溶液；其次，按照单因素试验方案既定的体积比例进行复配，加入适量的花生油和磷酸盐缓冲液，共配制60 mL大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白乳液；最后利用磁力搅拌器将复合乳液搅拌6 h，均质6次后，用于乳化活性指数和澄清指数测定。

1.2.2 单因素试验

搅拌时间固定为6 h，均质次数为6次。

（1） 体积比的确定。均质压力为500 bar，油相体积为4 mL，大黄鱼鱼卵磷脂溶液与酪蛋白溶液的体积比分别设定为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（V/V），比较不同复合体积比下复合体系的乳化活性指数和澄清指数。

（2）均质压力的确定。选择大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白的最优体积比（1∶2），油相体积4 mL，均质压力分别设定为300，400，500，600，700 bar，比较不同均质压力下复合体系的乳化活性指数和澄清指数。

（3）油相体积的确定。选择大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白的最优体积比（1∶2） 和最优均质压力（600 bar），油相体积分别设定为2，3，4，5，6 mL，比较不同油相体积下复合体系的乳化活性指数和澄清指数。

1.2.3 澄清指数测定

打开机器预热30 min，调整温度25℃，转速3 000 r/min，使用移液枪取适量均质后的复合乳液加入测量管中，测试得到澄清指数图表。

1.2.4 乳化活性指数测定

参考Molina E等人[22]的方法测定乳化活性。将均质完成的待测样品使用预先配置好的0.1%SDS溶液稀释至250倍，倒入比色皿中，紫外-可见分光光度仪经过预热30 min后，调节波长为500 nm，测量获得复合乳液样品的吸光度。计算乳化活性指数（EAI）：

EAI=2×2.303×A×N×C-1×φ-1×10 000-1.

式中：N——稀释倍数；

C——乳液形成前蛋白质质量浓度，g/mL；

φ——复合乳化液中油相体积分数，%；

A——乳液0 min时的吸光度。

1.2.5 喷雾干燥

将经过响应面优化后得到的大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系，设置好参数（进风温度80℃，压力0.3 MPa，通针间隔时长8 s，蠕动泵流速15 g/min），将乳液加入喷雾干燥机中，得到大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白固态基料。收集喷雾干燥后的固态基料，密封避光储存，用于后续的试验。

1.2.6 固态基料产品感官评定

（1）评价粉末产品的气味，对粉末产品的色泽及组织状态进行观察。

（2） 将粉末产品进行冲调（按照比例10 g/100 mL 55℃热水），评析其风味、口感及冲调性；

（3）将复原溶液静置24 h，分析其复水稳定性。

1.2.7 固态基料水分测定

将样品（2.5 g）置于烘箱中（温度105℃），直接干燥至恒质量。水分含量按照以下公式计算：

式中：m1——烘干前的样品质量，g；

m2——烘干后的样品质量，g。

1.2.8 固态基料休止角测定[23]

将固态基料通过一漏斗倒落在圆盘中心，待粉末呈锥体状并溢出圆盘边缘时停止注入。休止角即粉末锥状体与水平面所构成的夹角：

式中：H——锥体的高度，cm；

h——圆盘的高度，cm；

d——培养皿的直径，cm。

1.2.9 固态基料堆积密度测定[24]

将固态基料注入量器中，压实至刻度线并记录所需的固态基料质量（m） 及体积（V），固态基料堆积密度按照以下公式计算：

式中：m——样品的质量，g；

V——填充的体积，cm3。

1.2.10 固态基料溶解度测定[25]

将样品（2.5 g）置于烧杯中并加入蒸馏水（50 mL，25～30 ℃） 溶解，离心 （10 min，4 500 r/min） 2～3次获得沉淀物。将沉淀物移入恒质量称量瓶（m1），再于烘箱烘干至恒质量（m2），温度设置为105℃，溶解度通过以下公式计算：

式中：m——样品质量，g；

m1——称量瓶的质量，g；

m2——称量瓶与不溶物的质量，g；

B——样品的水分含量，%。

1.2.11 固态基料过氧化值的测定

参考GB 5009.227—2016测定固态基料的过氧化值。

1.2.12 固态基料的表面形态及微观结构

将少量样品均匀地撒在进样台的胶面上，拂去表面多余的粉末。真空喷金后，用扫描电镜（SEM）观察样品的表面形态及内部微观结构，调整合适的视野拍照并保存，设置加速电压为20 eV。

1.2.13 数据分析与处理

使用Design Expert 8.0.6软件进行响应面优化设计及结果分析，采用Origin Pro 9.1软件进行数据统计、分析与制图。

2 结果与分析

2.1 大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合溶液的制备

2.1.1 体积比的确定

澄清指数可以反映复合乳液的稳定性，乳化活性指数是反映乳液乳化性质的重要指标。另外，对乳化活性和澄清指数的测定包括空白对照组、5组试验组，并对6组进行3次平行测定，最后取平均值。

大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白体积比对乳化活性和澄清指数的影响见图1。

由图1可以看出，随着酪蛋白含量增加至体积比为1∶2，大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系的乳化活性指数随着酪蛋白含量的增多而升高；当体积比为1∶2时，乳化活性指数达到最大平均值49.47 m2/g，体积比由1∶3变化至1∶5，乳化活性指数随着酪蛋白含量的增多而降低。与此同时，随着酪蛋白所占比例的增加，复合体系的澄清指数呈现先减小后增大的趋势，在体积比为1∶2时，澄清指数下降到最小平均值0.031。可能是由于大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白通过疏水作用力结合，磷脂的量不变，当酪蛋白含量增大到一定程度时，磷脂的疏水性磷脂尾部基团所能包裹的疏水性蛋白区域达到极限[26]，说明大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白的混合已达饱和状态，磷脂的乳化性能趋于稳定。试验结果与王欢等人[21]保持一致，当磷脂与蛋白体积比为1∶2时，大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系的乳化活性指数较之更高，说明大黄鱼鱼卵磷脂的乳化能力较大豆磷脂更优。因此，取大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白体积比为1∶2作为后续试验操作参数。

2.1.2 均质压力的确定

均质压力对乳化活性和澄清指数的影响见图2。

由图2可以看出，随着均质压力的增大，大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系的乳化活性指数呈现先增大后减小的趋势，当压力达600 bar时，乳化活性指数达到最大平均值49.56 m2/g，逐渐增大均质压力使得蛋白分子结构逐渐变得松散，因而酪蛋白会暴露出更多的疏水基团，这些基团与磷脂的疏水尾部相互作用得到增强[27]，复合体系的亲水亲油程度同时增加，复合程度达到最大。进一步增大均质压力，乳化活性指数降低，可能是由于蛋白质-蛋白质分子间的疏水作用开始产生[28]，酪蛋白与大黄鱼鱼卵磷脂的作用受到竞争性抑制作用而减弱，乳化活性便开始降低。随着均质压力的增高，大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系的澄清指数呈现先减小后增大的趋势，当压力达到600 bar时，澄清指数出现最小平均值0.031，说明大黄鱼鱼卵磷脂和酪蛋白在均质压力600 bar下复合效果最优。因此，选择均质压力600 bar进行后续单因素试验。

2.1.3 油相体积的确定

油相体积对乳化活性和澄清指数的影响见图3。

由图3可以看出，随着油相体积的增加，大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系的乳化活性指数逐渐增大，当油相体积等于5 mL时，乳化活性指数上升至最大平均值49.32 m2/g，继续增加油相体积，乳化活性指数又呈下降趋势。这是由于油相体积的增加使得磷脂和蛋白分子的亲油基团与油相连接更加紧密，降低复合体系油-水界面的表面张力，体系稳定性达到最大且趋于稳定，再增加油相时反而会破坏油-水界面平衡。随着油相体积的增加，复合体系的澄清指数呈现逐渐减小的趋势，当油相体积为5 mL时，澄清指数平均值减至最小0.034，油相体积增加至6 mL时，澄清指数略有增大。因此，取油相体积5 mL作为后续试验操作参数。

单因素试验结果显示，大黄鱼鱼卵磷脂和酪蛋白体积比、均质压力和油相体积对复合体系的澄清指数有影响，但变化幅度不大；故以乳化活性指数为响应值，选择大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白体积比为1∶2，均质压力600 bar，油相体积5 mL为自变量进行后续响应面优化试验。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计与结果

利用Box-behnken试验设计对单因素试验进行优化分析，以大黄鱼鱼卵磷脂和酪蛋白复合比例、均质压力和油相体积为自变量，以乳化活性指数为响应值，利用响应面法对大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系制备工艺进行优化。

Box-behnken试验设计因素与水平设计见表1，响应面试验设计及结果见表2。

表1 Box-behnken试验设计因素与水平设计

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 响应面试验结果分析

使用Design Expert 8.0.6软件对响应面法试验数据进行分析，得到关于大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白体积比（A）、均质压力（B） 和油相体积（C） 的二次多项回归方程：

对该模型的显著性检验和方差进行分析。

回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

由表3可以看出，p＜0.000 1，说明试验所选回归模型极显著。失拟项p值为0.057 7（p＞0.05），表明未知因素对模型的试验结果干扰较小，可以用此模型分析和预测鱼卵磷脂-酪蛋白复合乳液体系的稳定性。该模型的一次项B、C和二次项A2，B2，C2极显著 （p＜0.01），交互项 AB 显著 （p＜0.05），通过方差分析得到回归模型的决定系数R2=0.982 3，R2的值越接近1，描述试验结果的准确度越高。试验的变异系数C.V.%=2.2＜10，其数值越小表明该试验的可靠性越高。从Adeq Precision=20.183＞4可以看出，模型的响应信号足以拟合试验的结果。

2.2.3 优化试验的结果验证

经响应面试验得出磷脂与蛋白的体积比、均质压力、油相体积对大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系稳定性的影响显著。选出最佳的工艺条件为大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白复合比例为0.56，均质压力为575.74 bar，油相体积为6 mL，在此条件下乳化活性指数的预测值为49.92 m2/g。为便于操作，将响应面模型所得优化条件修整为大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白体积比为1∶2，均质压力为600 bar，油相体积为6 mL；用该工艺条件重复进行3次试验验证优化结果，实际测得的乳化活性指数的平均值为49.49 m2/g，实际测量值与响应面预测值的相对误差为0.87%，说明经优化后得到的工艺参数具有一定的参考价值。

2.3 固态基料的感官状态及复水稳定性评价

参考中国水产行业标准SC/T 3505—2006可知，固态基料的品质受水分、氧化程度和结构等多个因素的影响；水产固态基料应为微鱼腥味、无酸败味、色泽均匀的粉末状产品；水分含量应小于或等于5%，过氧化值应小于或等于6 mmol/kg，表面光滑、致密且无裂纹，形态呈球状。

实验室制备的大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白固态基料见图4。

对固态基料产品（图4）及用60℃热水冲调的的样品进行感官评定。

感官评定结果分析见表4。

表4 感官评定结果分析

使用温度为60℃的水冲调固态基料样品，进行复水稳定性评定。

复水溶液的状态见图5。

固态基料样品冲泡时能在较短时间内溶解，表明其具备良好的溶解性。图5（a） 为固态基料冲调后的状态，为白色均匀液体，颗粒细小无絮片，表面无分层。由图5（b） 可知，复水溶液经放置24 h后，无沉淀及分层现象，品质几乎未受影响，可进一步加工应用于食品工业中。

2.4 固态基料的理化性质

大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白固态基料的基本理化指标见表5。

表5 大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白固态基料的基本理化指标

由表5可知，所得固态基料产品的水分含量低，仅为1.3%，固态基料的过氧化值为1.65 mmol/kg，明显低于中国水产行业标准SC/T 3505—2006规定的过氧化值，符合水产行业标准。氧化程度和水分含量均会影响固态基料的贮藏稳定性。干燥产品在储存期间水分含量为3%～4%，其具有良好的稳定性[29]；休止角越小，流动性能越好[30]。固态基料产品休止角为33.57°，说明粉体的黏性越小，具有良好的流动性。

2.5 粉末的微观结构

通过扫描电镜，可以观察到在最佳条件下（乳化活性指数为49.49 m2/g），经喷雾干燥制备的固态基料产品的表面形态。

固态基料的扫描电镜图见图6。

由图6可知，最佳条件下制备的固态基料多数为近球状，表面粗糙但无严重黏连现象，粒径介于5～30 μm。表面的褶皱与凹痕是喷雾干燥法制备粉末产品的普遍特征[31]。喷雾干燥机在实际运转过程中，其进气量达不到恒稳的状态，水分蒸发过程中速率不同产生不均匀收缩，导致固态基料产品的变形[32-33]；另外，扫描加压也使固态基料表面凹陷[34]，使得固态基料的大小和形态差异较大。经喷雾干燥制得的固态基料产品结构完整、表面致密无裂缝、略有凹陷，可有效隔绝氧气和湿度等外界不良因素的影响。

3 结论

以乳化活性指数为指标，在单因素试验基础上进行响应面优化分析，得出大黄鱼鱼卵磷脂-酪蛋白复合体系的最优配置参数为大黄鱼鱼卵磷脂与酪蛋白体积比1∶2（mL/mL），均质压力600 bar，油相体积6 mL。最佳条件下制备的固态基料产品具有良好的感官特性，气味协调无异味、颗粒细小、分散均匀、溶解性及水复溶性良好；结构致密完整，表面略有凹陷，无孔隙裂缝，粉末多为近球形，粒径介于5～20 μm，试验结果为大黄鱼加工副产物的高值化综合利用提供了前期理论基础。

但试验未能对该复合体系进行乳化稳定性的研究，乳液乳层析指数是表征乳液中油相和水相之间所达到的平衡稳定性的重要指标，可客观反映乳液的储存稳定性，后续可通过测定乳层析指数判断乳液的分层情况。也可在后续试验中对固态基料的营养价值及氧化贮藏稳定性进行探讨。