槲皮素联合CADM1对子宫内膜异位症细胞增殖和凋亡的影响

田 金，姚 丽，苏 敏，娄雪玲，张书伟

(1 郑州人民医院妇科，郑州 450003；2 郑州大学第三附属医院妇科，郑州 450003；3 郑州大学第一附属医院药剂科，郑州 450003)

子宫内膜异位症是指子宫内膜组织在子宫内膜以外的部位生长、浸润，能引起不孕、进行性痛经、月经不调等症状，严重影响女性健康和生活质量。近年来研究发现，中医药可改善卵巢功能异常、调节自身免疫、提高子宫内膜容受性[1-2]。槲皮素是一种天然小分子黄酮类化合物，广泛存在于多种中草药中，具有多种药理作用和生物学活性，能抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭、诱导癌细胞自噬和凋亡、增强药物及放射敏感性、逆转耐药性等[3]。有研究报道，槲皮素可抑制大鼠子宫内膜异位症模型中异位内膜的生长，且与达那唑联合治疗效果更显著[4-5]。槲皮素还可上调Caspase-9、Caspase-3，下调Bcl-2的表达，促进细胞凋亡，从而抑制异位内膜生长。细胞黏附因子1(cell adhesion molecule-1，CADM1)是CADMs家族成员之一，研究发现，CADM1在多种肿瘤细胞中具有抑制细胞增殖、黏附和转移以及诱导肿瘤细胞凋亡的作用[6]。据报道，CADM1在子宫内膜异位症患者组织中低表达，其可能与子宫内膜异位症的发生、发展有关[7]。但CADM1对子宫内膜异位症细胞增殖和凋亡的影响及其与槲皮素联合作用对子宫内膜异位症细胞影响尚未阐明，本研究旨在探讨槲皮素和CADM1对子宫内膜异位症细胞增殖和凋亡的影响及其联合作用的效果是否更显著。

1 材料与方法

1.1 细胞核试剂

子宫内膜异位症细胞End1/E6E7购自中国科学院上海生科院细胞资源中心；胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；槲皮素购自四川省维克奇生物科技有限公司；LipofectamineTM2000购自Sigma公司；MTT试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)试剂盒、BCA试剂盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体购自上海煊翎生物科技有限公司；载体、质粒均由金瑞斯生物科技公司构建。

1.2 细胞培养

子宫内膜异位症细胞End1/E6E7用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，2天换液一次，待细胞融合至80%左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 药物处理与分组

当细胞融合至80%左右时，将细胞传代接种至96孔板中，用20 μg/mol的槲皮素处理End1/E6E7细胞，作为Quercetin组；未经任何处理的细胞，作为对照组(Control组)。将pcDNA-CADM1转染至End1/E6E7细胞，记为pcDNA-CADM1组；将pcDNA-CADM1转染至End1/E6E7细胞后用20 μg/mol的槲皮素处理，记为Quercetin+pcDNA-CADM1组，转染均采用LipofectamineTM2000转染试剂盒。

1.4 Western Blot检测蛋白表达

收集各组细胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，然后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品重复3次。

1.5 MTT法检测细胞活力

在各组细胞培养至48 h时加入20 μl (5 g/L)的MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μl DMSO振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(A)值。细胞活力(%)=实验组A值/空白对照组A值×100。每组重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各组细胞，离心收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度。实验重复3次。

1.7 流式细胞术检测细胞周期

细胞转染72 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，然后1000 r/min离心5 min，去上清，PBS重悬洗涤2次；1000 r/min离心5 min，去上清，100 μl PBS重悬细胞，缓慢加入700 μl预冷的80%乙醇，使乙醇终质量浓度为70%，4 ℃固定24 h以上，1000 r/min离心5 min，预冷PBS洗涤2次，加入100 μl核糖核酸酶A(RNase A，50 mg/L)，37 ℃水浴30 min，加入400 μl PI(50 mg/L)，4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪检测PI荧光强度，用Modfit软件计算Sub G0/G1期、G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 各组子宫内膜异位症细胞End1/E6E7中CADM1的表达量

与Control组相比，Quercetin组和pcDNA-CADM1组End1/E6E7细胞中CADM1的表达水平均升高；与Quercetin组和pcDNA-CADM1组相比，Quercetin+pcDNA-CADM1组End1/E6E7细胞中CADM1的表达水平升高(P<0.05)。见图1和表1。可见，槲皮素和过表达CADM1均可促进子宫内膜异位症细胞End1/E6E7中CADM1的表达，且槲皮素联合CADM1效果更显著。

图1 Western Blot检测End1/E6E7细胞中CADM1的表达

表1 各组End1/E6E7细胞中CADM1的表达量

与Control组比较，a：P<0.05；与Quercetin组比较，b：P<0.05；与pcDNA-CADM1组比较，c：P<0.05；下同

2.2 槲皮素和CADM1对End1/E6E7细胞增殖的影响

与Control组相比，Quercetin组和pcDNA-CADM1组End1/E6E7细胞活力均降低；与Quercetin组和pcDNA-CADM1组相比，Quercetin+pcDNA-CADM1组End1/E6E7细胞活力降低(P<0.05)。见表2。可见，槲皮素和过表达CADM1均可抑制子宫内膜异位症细胞增殖，且槲皮素联合CADM1抑制效果更显著。

表2 槲皮素和CADM1对End1/E6E7细胞增殖的影响

2.3 槲皮素和CADM1对End1/E6E7细胞凋亡的影响

与Control组相比，Quercetin组和pcDNA-CADM1组End1/E6E7细胞凋亡率均升高，Bax表达水平均升高，Bcl-2表达水平均降低；与Quercetin组和pcDNA-CADM1组相比，Quercetin+pcDNA-CADM1组End1/E6E7细胞凋亡率升高，Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低(P<0.05)。见图2、表3和图3。可见，槲皮素和过表达CADM1均可促进子宫内膜异位症细胞凋亡，且槲皮素联合CADM1促进效果更显著。

图2 槲皮素和CADM1对End1/E6E7细胞凋亡的影响

表3 槲皮素和CADM1对End1/E6E7细胞凋亡的影响

图3 Western Blot检测End1/E6E7细胞中凋亡相关蛋白的表达

2.4 槲皮素和CADM1对End1/E6E7细胞周期的影响

与Control组相比，Quercetin组和pcDNA-CADM1组Sub G0/G1期细胞比例升高，G0/G1期细胞比例降低(P<0.05)；S期和G2/M期细胞比例无显著变化。与Quercetin组和pcDNA-CADM1组相比，Quercetin+pcDNA-CADM1组Sub G0/G1期细胞比例均升高，G0/G1期细胞比例均降低(P<0.05)；S期和G2/M期细胞比例无显著变化。见表4。可见，槲皮素和过表达CADM1能使End1/E6E7细胞阻滞于G0/G1期，且槲皮素联合CADM1效果更显著。

表4 槲皮素和CADM1对End1/E6E7细胞周期的影响

3 讨论

子宫内膜异位症是一种妇科进展性疾病，发病机制复杂，且发病率呈不断上升趋势。近年来，中医药临床治疗取得良好的疗效[8-9]。槲皮素是从中药及天然植物中提取的黄酮类化合物，具有抗肿瘤细胞增殖及促肿瘤细胞凋亡的作用[10]。有研究表明，槲皮素可抑制子宫内膜异位症细胞的增殖并诱导其凋亡[11]，可逆转子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-CI(ADR+/+)细胞多药耐药性[12]。此外，槲皮素还能抑制宫颈癌HeLa细胞的生长及促进其凋亡[13]，并增强顺铂对HeLa细胞黏附、迁移及侵袭的抑制作用[14]。本研究结果显示，槲皮素可抑制子宫内膜异位症细胞End1/E6E7的增殖，促进细胞凋亡；且能促进Bax的表达，抑制Bcl-2的表达，进一步说明槲皮素可促进子宫内膜异位症细胞凋亡。这与前人研究结果相符，说明槲皮素具有抗肿瘤效果。

槲皮素可显著抑制系膜细胞增殖，使系膜细胞阻滞于G0～G1期[15]；使结肠癌BIU-87细胞周期阻滞于G2/M期[16]；通过诱导P53非依赖性的G2/M细胞周期阻滞和细胞凋亡，从而实现抑制肿瘤细胞增殖的作用[17]。以上结果均表明槲皮素可通过阻滞细胞周期而抑制细胞增殖。细胞分裂都经由G1-S-G2-M期，G0/G1是细胞周期关键环节，通过调控G0/G1可阻止肿瘤细胞增殖。本研究结果显示，槲皮素可增加Sub G0/G1期细胞，减少G0/G1期细胞，而S期和G2/M期细胞无显著差异变化，说明槲皮素可能通过将细胞阻滞于G0/G1期而抑制子宫内膜异位症细胞增殖。

CADMs家族又属于免疫球蛋白超家族，CADM1作为CADMs家族一员可以诱导免疫细胞识别和杀伤肿瘤细胞[18]。研究发现，阻断CADM1可以减少胰腺癌细胞晚期凋亡[19]；CADM1过表达可抑制胃癌细胞增殖和侵袭[20]，以及抑制肝癌细胞生长并负向调节G1/S转换[21]。且有研究表明，CADM1在子宫内膜异位症患者组织中低表达。本研究为探讨CADM1对子宫内膜异位症细胞增殖和凋亡的影响，转染CADM1过表达载体，结果显示，细胞活力降低，细胞凋亡率升高，Sub G0/G1期细胞增加，G0/G1期细胞减少。说明过表达CADM1可抑制子宫内膜异位症细胞的增殖，促进细胞凋亡。

为探讨槲皮素和CADM1两者联合作用对子宫内膜异位症细胞增殖和凋亡的影响，本研究在转染CADM1过表达载体的同时用槲皮素处理，结果显示，相比单独过表达CADM1，过表达CADM1的同时用槲皮素处理，CADM1表达水平升高，说明槲皮素可促进CADM1的表达。且相比单独槲皮素处理或单独过表达CADM1，过表达CADM1的同时用槲皮素处理，细胞活力降低，细胞凋亡率升高，Sub G0/G1期细胞增加，G0/G1期细胞减少。说明槲皮素联合CADM1对子宫内膜异位症细胞End1/E6E7的增殖抑制和凋亡促进效果更显著，且其可能是通过调控细胞周期，促进细胞凋亡进而抑制细胞增殖的。

综上，槲皮素和CADM1均可抑制子宫内膜异位症细胞增殖，促进细胞凋亡，增加Sub G0/G1期细胞，减少G0/G1期细胞，且槲皮素联合CADM1作用效果更显著，有望为子宫内膜异位症的治疗提供新思路和新靶点。