核转录因子Sp1在手术创伤后腹膜组织中的活性改变与腹膜粘连形成关系探讨

陈立堂，陈勇平

（广东省惠东县人民医院1急诊科，2普通外科，广东 惠州516300）

腹部外科手术极易引发术后腹膜粘连形成，通常情况下会引发疼痛、肠梗阻等，同时使再次手术的难度增加［1-2］。目前，临床尚未清楚腹膜粘连形成的分子机制。在纤维化过程中，核转录因子Sp1在胶原的合成与表达启动中发挥着极为重要的作用［3］。本研究探讨核转录因子Sp1在手术创伤后腹膜组织中的活性改变与腹膜粘连形成关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年8月至2019年8月我院收治的直肠癌手术患者108例，分为正常腹膜组 （开腹后第一时间将腹膜组织从切口左侧2.0 cm处锐性切取）和创伤腹膜组 （手术后将腹膜组织从切口右侧2.0 cm处锐性切取），每组各54例。组织获取后第一时间保存在液氮中备用。正常腹膜组中男34例，女20例，年龄26～85岁，平均 （55.6±9.4）岁。创伤腹膜组中男33例，女21例，年龄27～85岁，平均 （56.2±9.8）岁。两组的一般资料比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）。

1.2 方法①腹膜组织核蛋白提取与Sp1探针标记：依据美国PIERCE公司生产的NE-PERTM核蛋白抽提试剂盒方法将各组腹膜组织中的核蛋白提取出来，运用Bradford法对核蛋白浓度进行测定，然后在-70℃的温度下分装保存备用。依据加拿大GENEKA公司生产的Sp1 NUSHIFT检测试剂盒对Sp1双链寡核苷酸探针进行标记，T4多核苷酸激酶作用下用 ［γ-32P］ATP对其5'端进行标记，经MicroSpinTMG25分离柱纯化后对探针放射活性进行测定。②腹膜组织核转录因子Sp1的DNA结合活性与特异性检测：依据加拿大GENEKA公司生产的Sp1 NUSHIFT检测试剂盒，将 4 μL DNA结合缓冲液 ＋10 μg核蛋白提取物加入0.5 mL Eppendorf管中，在4℃的温度下进行20 min的孵育，将1 μL已标记寡核苷酸双链探针加入其中，在4℃的温度下继续进行20 min的孵育，将4 μL加样缓冲液加入其中，混匀，加样。同时进行Sp1特异性竞争抑制实验，两组均设立特异性对照检测，一组将50倍未标记变异寡核苷酸探针加入，另一组将50倍未标记特异寡核苷酸探针加入，在非变性聚丙烯酰胺凝胶60 g／L中进行2 h电泳，电压为180 V，干胶，放射自显影。采用Bandscan分析软件测定电泳条带灰度，计算平均光密度 （A）。核转录因子活性用各条带A值表示。③腹膜组织的Masson染色：常规石蜡切片腹膜组织，脱蜡入水，用天青石溶液对细胞核进行20 min染色，Masson红染液10 min，后水洗，10 mL醋酸水溶液1 min，5 g／L亮绿，镜下变绿后以较快的速度脱水、透明、封片。

1.3观察指标观察两组手术后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h的Sp1活性，Sp1抑制性竞争实验，腹膜组织的胶原纤维变化。

1.4统计学分析采用SPSS 21.0处理数据，计量资料 （±s）采用t检验，计数资料 （%）采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组腹膜组织中Sp1活性比较创伤腹膜组手术后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h的Sp1活性逐渐升高 （P＜0.05），且均显著高于正常腹膜组 （P＜0.05）。见表1。

表1 两组腹膜组织中Sp1活性比较 （±s）

表1 两组腹膜组织中Sp1活性比较 （±s）

注：与正常腹膜组比较，*P＜0.05。

手术后3 h指标手术后3 0 m i n手术后1 h手术后2 h创伤腹膜组 （n=5 4） 正常腹膜组（n=5 4）手术后4 h S p 1 活性 6 1.1±1 1.5*8 8.3±1 5.7*1 0 4.5±1 5.2*1 2 2.3±2 7.0*1 3 4.5±1 8.3*3 1.1±5.2

2.2 Sp1抑制性竞争实验50倍未标记特异寡核苷酸完全抑制第3泳道，无条带；50倍未标记变异寡核苷酸未抑制第4泳道，较第1泳道、第2泳道有结合的特异性 （图1）。

图1 Sp1抑制性竞争实验

2.3 腹膜组织的胶原纤维变化转录因子Sp1随着手术创伤时间的延长被活化，手术后30 min腹膜组织中具有较厚的胶原层、较为粗大的纤维细胞、紊乱的排列，胶原纤维增生 （图2）。

3 讨论

Sp1归属于 Sp特异性蛋白／Kr-uppel样因子 （Sp／SKLF）转录因子家族，在所有被克隆因子中被克隆时间最早，形成途径为3个保守Cys2His2锌指特异结合［4］。转录因子DNA连接区域在3个锌指的作用下形成，临床普遍认为，Sp1对所有基因转录进行控制的途径为通过GT或GC盒调节［5］。相关抑制腹膜粘连形成的研究［6］中，运用凝胶电泳迁移率改变分析法对人腹膜组织中手术创伤后不同时间的Sp1表达水平进行了测定，以期为Sp1的特异性调控提供一定的理论依据，发现腹膜粘连形成一定程度上受到核转录因子Sp1活化的影响。

图2 腹膜组织胶原Masson染色 （×200）

本研究结果显示，创伤腹膜组手术后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h的Sp1活性逐渐升高 （P＜0.05），且均显著高于正常腹膜组 （P＜0.05）。50倍未标记特异寡核苷酸完全抑制第3泳道，无条带；50倍未标记变异寡核苷酸未抑制第4泳道，较第1泳道、第2泳道有结合的特异性。本结果表明，转录因子Sp1随着手术创伤时间的延长被活化，手术后30 min腹膜组织中具有较厚的胶原层、较为粗大的纤维细胞、紊乱的排列，胶原纤维增生，与上述研究［6］结果一致。

综上所述，核转录因子Sp1在手术创伤后腹膜组织中的活化会在一定程度上引发腹膜粘连形成，值得临床充分重视。