去泛素化酶3在肺癌组织中的表达及对肺癌细胞上皮间质转化、迁移和侵袭的影响

肖蓓 邓小婧

肺癌是一种全球范围内常见的恶性肿瘤，分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其死亡率较高，且呈现连年上升趋势，85%～90%的肺癌类型为非小细胞肺癌[1]。因取样困难等因素的限制使得早期肺癌难以被发现。大部分肺癌发现时，癌细胞已发生转移，因此导致肺癌患者死亡的主要原因是肺癌细胞转移[2]。因此，弄清楚肺癌细胞的扩散机制对于诊断、治疗肺癌及其预后均有显著的临床意义。去泛素化酶3(ubiquitin-specific protease 3,USP3)于1999年被发现[3]，能够促进正常细胞的凋亡，在癌细胞增殖过程中起着重要调节作用[4]：在肝癌细胞中检测到较高表达量的USP3蛋白[5]；敲低人骨肉瘤细胞U2OS中USP3表达时，细胞增殖受到显著抑制[6]。目前尚不清楚肺癌组织中USP3的表达水平以及其对于肺癌细胞的上皮间质转化、迁移和侵袭的影响。为此，本实验检测肺癌组织中的USP3的转录和表达水平，并分析其对A549细胞的皮间质转化、迁移和侵袭的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年7月至2019年2月于我院确诊的87例肺癌患者为研究对象，其中男49例，女38例；年龄(53～74)岁，平均年龄(65.83±1.62)岁；体重55～63 kg，平均(57.43±3.91)kg；病程10～23个月,平均(15.11±3.63)个月。患者均无其他严重并发症。本研究已获医院伦理委员会批准，所有患者及家属知情并签署同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：所有患者符合《肿瘤学》[7]中肺癌的诊断标准，并且经病理组织学确诊。

1.2.2 排除标准：接受过化疗的患者；同时患有其他恶性肿瘤的患者；影像学资料、病历资料等不完整的患者。

1.3 RT-PCR检测 患者术后从肺癌组织和癌旁组织中取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm组织各1块。提取所有样本RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix (AT401-01)试剂盒进行反转录，获得cDNA。根据GeneBank中USP3的序列(NR_046342.1)并借助primer 5.0设计特异性引物(F：5’-TGAATGCCATCCTTCAGTCA-3’； R：5’-CTTGGCTCCTGGTGTGGTAT-3’)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将上述cDNA作为模板，按照PCR程序进行扩增：95℃,5 min;95℃,30 s;55℃，30 s;72℃,1 min;30个循环；72℃,10 min。PCR产物经核酸凝胶电泳后置于Bio-Rad凝胶成像系统 (SYSTEM GelDoc XR+,1708195) 中成像。使用Image J分析软件进行灰度值分析，检测USP3的转录水平。

1.4 Western blot 检测 上海抚生实业有限公司购买A549细胞，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM细胞培养液中，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。以3.0×105个/孔的密度接种12孔板，培养24 h后，收集细胞，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳：浓缩胶恒压80 V， 20 min；分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。使用Bio-Rad半干转印槽(Trans-Blot SD,170-3940)在恒压15 V，30 min条件下转印至PVDV膜(生工，F019532-0010)。取下PVDF膜放入封闭液(TBST，5%脱脂奶粉，pH值7.4)中室温孵育2 h；使用sigma公司生产的USP3一抗稀释液 (SAB1410046，1∶5 000) 室温孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生产的HRP标记的二抗羊抗鼠IgG 稀释液 (HS201-01,1∶10 000) 室温孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根据ECL化学发光液(上海天能)使用说明，将PVDF膜置于Bio-Rad凝胶成像系统中显影。实验重复3次。采用上述方法，利用E-cadherin抗体(GeneTex,GTX100443)及Vimentin抗体(GeneTex,GTX112661)检测3组细胞中的做表格计算F值和P值的表达水平。

1.5 RNA干扰 针对USP3的序列(613-635，AGCTACAGTACATACTGTTATCG)，利用在线工具siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)设计并合成小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA):5’-AUAACAGUAUGUACUGUAGCU-3’及5’-CUACAGUACAUACUGUUAUCG-3’。以及阴性对照siRNA：5’-UACUUAUAACGUAGCAGUAUG-3’及5’-AUGAAUAUUGCAUCGUCAUAC-3’。将A549细胞分为3组，其中转染阳性siRNA的为siRNA-USP3组；转染阴性siRNA的为siRNA-control组；不做处理的为对照组。转染6 h 后更换培养基，继续培养24 h后，利用Western blot方法检测3组细胞中的USP3的表达水平。实验重复3次。

1.6 细胞划痕实验 将3组A549细胞接种到6孔板中(6×105)，分别转染PBS、siRNA-control以及siRNA-USP3。24 h后，用20 μl枪头垂直于孔底划痕。用PBS清洗3次，换新鲜的细胞培养液，放入37℃，5% CO2培养箱中培养，在0 h沿划痕边缘等间距取三处测量划痕宽度的平均值，48 h后在相同位置测量宽度。按照下列公式计算愈合率：愈合率(%)=(0 h宽度-48 h宽度)/0 h宽度×100%。

1.7 Transwell小室实验 肺癌细胞转染 siRNA 24 h后，消化细胞于无血清培养基。将2.5×104个细胞加入铺有基质胶的24孔Transwell小室的上室，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的培养基。于 37℃， 5% CO2条件下培养。24 h后取出Transwell小室，用棉签擦掉基质胶及上室未穿膜细胞。甲醇固定10 min，0.2%结晶紫染色40 min，100倍镜下随机选取5个视野计数穿膜细胞数目，取平均值。每组实验重复3次。

2 结果

2.1 USP3在肺癌组织和癌旁组织中的表达水平比较 RT-PCR及Western blot显示，USP3在肺癌组织中的转录及表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。见表1，图1。

组别USP3(转录)USP3(表达)癌旁组织0.27±0.060.20±0.04肺癌组织0.95±0.190.89±0.18t值31.83034.900P值0.0000.000

图1 USP3在肺癌组织和癌旁组织中的转录(A)和表达(B)水平

2.2 RNA干扰效果检测 3组细胞中USP3的表达差异有统计学意义(P<0.05)。其中，对照组和siRNA-control组中USP3的表达量差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA-USP3组中USP3的表达量显著低于其他2组(P<0.05)。表明siRNA-USP3组细胞中USP3蛋白表达被抑制。见表2，图2。

组别USP3对照组 1.20±0.24siRNA-control组1.12±0.22siRNA-USP3组 0.22±0.04∗#F值41.280P值0.000

注：与对照组比较，*P<0.05；与siRNA-control组比较，#P<0.05

图2 USP3敲低效果检测

2.3 敲低USP3对肺癌细胞上皮间质转化的影响 3组细胞中E-cadherin和Vimentin的表达均存在显著差异(P<0.05)。其中，对照组和siRNA-control组中E-cadherin和Vimentin的表达量差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA-USP3组中E-cadherin的表达量显著高于其他2组(P<0.05)；siRNA-USP3组中Vimentin的表达量显著低于其他2组(P<0.05)。见表3，图3。

组别E-cadherinVimentin对照组 0.55±0.111.21±0.24siRNA-control组0.52±0.101.17±0.23siRNA-USP3组 1.16±0.23∗#0.65±0.13∗#F值26.09011.490P值0.0000.002

注：与对照组比较，*P<0.05；与siRNA-control组比较，#P<0.05

图3 敲低USP3对肺癌细胞上皮间质转化的影响

2.4 敲低USP3对肺癌细胞迁移的影响 3组细胞愈合率差异有统计学意义(P<0.05)。其中，对照组和siRNA-control组中愈合率差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA-USP3组中愈合率显著低于其他2组(P<0.05)。见表4，图4。

组别0 h(mm)48 h(mm)愈合率(%)对照组 10.01±2.003.24±0.6567.62±13.52siRNA-control组10.02±2.003.18±0.6468.28±13.66siRNA-USP3组9.98±1.997.57±1.51∗#24.16±4.83∗#F值0.00130.54024.420P值0.9990.0000.000

注：与对照组比较，*P<0.05；与siRNA-control组比较，#P<0.05

图4 敲低USP3对肺癌细胞迁移的影响

2.5 敲低USP3对肺癌细胞侵袭的影响 3组细胞的计数值差异有统计学意义(P<0.05)。其中，对照组和siRNA-control组中细胞数量差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA-USP3组中细胞数量显著低于其他2组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5，图5。

表5 敲低USP3对肺癌细胞侵袭的影响 个,

注：与对照组比较，*P<0.05；与siRNA-control组比较，#P<0.05

图5 敲低USP3对肺癌细胞侵袭的影响

3 讨论

肺癌造成高死亡率的主要原因在于癌细胞转移。有统计显示，癌细胞在20%首次确诊的小细胞肺癌患者体内已发生脑转移，死亡患者中发现的脑转移率可高至80%[8]。因此，研究肺癌的转移机制具有重要意义。

虽然早在1999年就已经发现USP3蛋白，但关于其功能研究相对较少。有研究表明，USP3在细胞癌变中发挥了重要作用[9]，肝癌组织和肝癌细胞中USP3的表达水平较高[5]。此外，Fang等[10]发现，胃部癌变时，也检测到USP3过表达。Wang等[11]发现，结肠癌细胞HCT116、LoVo等的转移与USP3过表达有密切关系。我们的实验结果也发现，USP3在肺癌组织中的转录水平和蛋白表达量显著高于癌旁组织组织。为探讨USP3的异常表达与肺癌细胞发生的关系，我们利用RNA干扰技术将A549细胞中USP3敲低，与未处理的A549细胞相比，进一步检测了敲低USP3后，A549细胞的间质转化、迁移和侵袭性能的变化情况。

本文设计合成了USP3的siRNA，对A549细胞转染后发现，与siRNA-Control组相比较，siRNA-USP3组细胞中USP3蛋白质的表达降低，表明siRNA对USP3的抑制效果较好。

划痕愈合实验及Transwell试验结果显示，与siRNA-Control组相比较，siRNA-USP3组细胞在培养48 h后，迁移和侵袭细胞数量降低，表明USP3敲低可以抑制肺癌细胞A549的迁移和侵袭。

癌细胞的转移、侵袭是复杂的过程，涉及许多因素，最常见的就是EMT。EMT现象存在于肿瘤的所有阶段，主要分子特征是上皮细胞标记蛋白E-cadherin表达减少，Vimentin表达增多[12]。肿瘤细胞间迁移和侵袭能力在发生EMT的时候显著增强。因此，本实验同时各组细胞中E-cadherin和Vimentin的表达水平进行检测。结果显示，在USP3表达降低的细胞中，其E-cadherin表达量显著增加，Vimentin表达量降低，表明USP3敲低可以抑制肺癌细胞A549的间质转化。

综上所述，USP3在肺癌组织中呈现高表达。USP3敲低可以抑制肺癌细胞上皮间质转化、迁移和侵袭，可将USP3作为肺癌治疗的新方向。

本文仍存在不足：(1)样本量不多，不能更加完整、真实地反应临床状况，今后的研究中需要采集更多的临床病例，增加实验样本数量。(2)本次实验在细胞学水平初步验证了USP3的作用，但是无法代表体内的真实情况，仍需构建肺癌的动物模型，进一步模拟体内真实环境，得出较贴近真实情况的数据。(3)本文仅对USP3与肺癌的作用做了初步探索，今后需要挖掘与之有关的信号通路蛋白，以完善肺癌发生、发展机制。