Aβ1-42诱导的老年性痴呆大鼠血清中miR-221表达与认知功能的关系

孙永 孙辉 姚凯华 李志锋 李永文

作为一种常见的中枢神经系统退行性疾病，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又被称为老年性痴呆，其临床特征主要表现为进行性记忆障碍、认知功能障碍、行为失常及人格改变[1-3]。细胞间淀粉样斑块及大量的神经原纤维缠结是该病的主要病理学特征[4]。环境、遗传等被认为是导致发病的重要因素，淀粉样级联假说认为β-淀粉样蛋白聚集于细胞外形成纤维状，进一步发展为老年斑，引起局部组织发生炎症甚至导致神经细胞凋亡，但目前关于其发病机制仍未有明确定论[5,6]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类非编码的可调控基因表达的小分子RNA，在血清、乳汁、唾液及尿液等中均被检测到[7,8]。近年来，诸多研究表明miRNA与肿瘤、神经退行性疾病等多种疾病相关，血清中miRNA的种类和水平可用于反应疾病的类型、进展及机体的生理状况[9,10]。关于老年性痴呆患者血清中miR-221水平与认知功能的关系尚未见报道，因此本研究采用淀粉样蛋白(Aβ1-42)诱导AD大鼠模型，以探讨大鼠模型血清中miR-221的表达水平与认知功能的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞株及主要试剂 8～12周龄SPF 级健康雄性Sprague—Dawley(SD) 大鼠[合格证号：SYXK(京)2013-0032]60只，体重200～300 g/只，于北京维通利华实验动物技术有限公司采购，将大鼠随机分笼，于60%～70%湿度、21℃～26℃室温下适应性饲养1周，期间让其自由饮水饮食。Aβl-42购自北京中杉金桥，使用前将其用无菌0.9%氯化钠溶液稀释至10 μg/μl，置于37℃作用1周，使其成聚集态。荧光定量PCR试剂盒及Trizol均购自为TAKARA公司。jet PRIME购自美国polyplus公司。miR-221过表达慢病毒及miR-221空载体对照由上海吉凯设计并构建。兔多克隆抗体to BACE1(Anti-BACE1抗体，ab2077)购自Abcam。

1.2 大鼠建模 将60只大鼠随机分为Aβ1-42诱导的AD组、AD+miR-221过表达组、AD+空载体组及正常对照组，每组15只。Aβ1-42诱导的AD方法：采用腹腔注射10% 水合氯醛(30 mg/kg)的方法麻醉大鼠，用脑立体定位仪(日本NARISHIGE型)将大鼠头部固定，头顶部去毛，碘伏棉球消毒手术区，取颅顶中部作小纵切口使颅骨暴露，首先定位前囟并于其中线处旁开，向后、向下各3.0 mm，用1 mm牙科钻于颅骨上打两个对称孔，作为海马区注射点。将硬脑膜用针挑破，双侧海马区各注射10 μg Aβ1-42，为使溶液充分弥散，注射时间控制在10 min，之后留针10 min，撤针时需缓慢。针孔用牙托粉填补，同时为防止伤口感染可使用庆大霉素，将皮肤缝合并再次消毒。术后大鼠完全清醒前进行单笼饲养。AD+miR-221过表达组、AD+miR-221空载体组分别于AD大鼠尾静脉注射miR-221慢病毒质粒及空载体质粒，正常对照组不进行任何处理。

1.3 RT-qPCR检测4组大鼠血清中miR-221水平 各组大鼠建模完成后1周，采用断尾采血的方式收集大鼠血液，离心，分离血清，-80℃保存备用。用Trizol法提取总RNA并反转录为cDNA，以得到的该cDNA为模板进行荧光定量PCR，检测血清中miR-221的表达水平。同时以U6作为内参基因。每个样本均进行3次重复实验。

1.4 水迷宫实验 4组大鼠建模完成后7 d进行水迷宫实验，定位航行实验训练连续进行4 d，4次/d，分别取不同象限的固定位置作为入水点，保持25～28℃的水温，将大鼠放入水中时面向水池壁，大鼠入水到其找到平台的时间作为逃避潜伏期。若大鼠入水2 min内未找到平台则轻轻将其拖上平台休息30 s，若大鼠自行在2 min内找到平台，则让其在平台上休息30 s。从4个入水点将大鼠分别放入水池即为1次训练，计算机全程跟踪各大鼠训练过程，游泳距离取4次总行程的平均值，计算逃避潜伏期。以第5天的成绩平均值作为最终实验结果。

1.5 海马区和大脑皮质神经元毒性检测 大鼠建模完成后存活8周，以腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g/kg)的方式将其麻醉，然后依次用0.9%氯化钠溶液200 ml、含5%戊二醛的1%多聚甲醛400 ml进行灌流固定，取出大鼠海马及大脑皮质，冷冻切片后采用丙酮固定，最后经常规HE染色后观察。

1.6 Western-blot检测大脑组织中BACE1蛋白 大鼠建模完成后存活8周，取大鼠大脑组织，用动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒，提取组织总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。制备蛋白样品，并进行SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，加含有5%BSA的封闭液室温下孵育2 h，加入用封闭液稀释的Anti-BACE1抗体，4℃冰箱过夜孵育。次日取出复温后，PBST洗膜3次，每次10 min，再加稀释好的HRP标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h，PBST洗膜，加ECL进行显色，暗室曝光拍照，同时以GAPDH作为内参蛋白。

2 结果

2.1 4组大鼠血清中miR-221的表达水平 采用RT-qPCR检测4组大鼠血清中miR-221表达水平，以U6作为内参基因，以正常对照组作为标准，AD组、AD+空载体组及AD+miR-221过表达组中miR-221水平均显著低于对照组(P<0.05)，AD+miR-221过表达组高于AD组、AD+空载体组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。

组别miR-221表达水平正常对照组1.05±0.13AD组0.57±0.08∗#AD+空载组0.59±0.09∗#AD+过表达组0.77±0.11∗

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与AD+过表达组比较，#P<0.05

图1RT-qPCR检测4组大鼠血清中miR-221表达水平;与正常对照组比较，*P<0.05；与AD组、AD+空载体组比较，#P<0.05

2.2 4组大鼠的认知功能 水迷宫实验检测4组大鼠的认知功能，结果显示，与正常对照组比较，AD组、AD+空载体组及AD+miR-221过表达组大鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.05)；AD+miR-221过表达组与AD组、AD+空载体组比较，大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图2。

组别逃避潜伏期正常对照组10.19±0.89AD组27.38±2.12∗#AD+空载组27.51±2.09∗#AD+过表达组14.71±1.91∗

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与AD+过表达组比较，#P<0.05

图2水迷宫实验检测4组大鼠的认知功能;与正常对照组比较，*P<0.05；与AD组、AD+空载体组比较，#P<0.05

2.3 4组大鼠海马区神经元毒性检测结果 HE染色后显微镜下观察，正常对照组大鼠海马区CAI区保持完整结构，神经元具有正常形态，整齐排列并且均匀分布。AD组大鼠海马区神经元损伤严重，CAI区锥体细胞数量减少，体积变小，排列紊乱，胞质呈淡红色，胞核大量固缩且呈蓝黑色。AD+空载体组与AD组相近。AD+过表达组相比AD组和AD+空载体组改善显著。见图3。

图3 4组大鼠海马区的形态学变化(HE染色×400);A 正常对照组;B AD组;C AD+空载体组;D AD+过表达组

2.4 4组大鼠大脑皮质神经元毒性检测结果 正常对照组大脑皮质神经元紧密规则排列，细胞核位于细胞中央，染色浅、大而圆，未见损伤。AD组大脑皮质区神经元大量凋亡，体积变小，胞质呈淡红色，嗜酸性增强，胞核固缩，呈蓝黑色，染色质呈团块状。AD+空载体组与AD组相近。AD+过表达组与AD组和AD+空载体组比较显著改善，趋向于正常对照组。见图4。

2.5 大脑组织中BACE1蛋白表达 Western-blot检测结果显示，与正常对照组比较，AD组和AD+空载体组大脑组织中BACEl蛋白表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；AD组和AD+空载体组差异无统计学意义(P>0.05)；AD+过表达组显著低于AD组和AD+空载体组(P<0.05)，高于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3，图5。

图44组大鼠大脑皮质区的形态学变化(HE染色×400);A 正常对照组;B AD组;C AD+空载体组;D AD+过表达组

组别BACEI/GAPDH正常对照组0.32±0.09AD组0.95±0.19∗AD+空载组0.92±0.18∗AD+过表达组0.46±0.12∗#

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与AD组、AD+空载体组比较，#P<0.05

图5Western-blot检测大鼠大脑组织中BACE1蛋白;与正常对照组比较，*P<0.05;与AD+过表达组比较，#P<0.05

3 讨论

作为老年性痴呆患者脑内老年斑的主要成分，含有39～43个氨基酸多肽的β-淀粉样蛋白(Aβ)，由淀粉样前体蛋白(APP)水解产生后又因机体代谢障碍而于海马、基底核等部位沉积，可使神经纤维缠结，从而诱导神经元产生退行性病变以及学习记忆障碍[11-13]，因此Aβ可用于建立AD动物模型。微小RNA(microRNA，miRNA)属于内源性非编码小RNA，约包含21～23个碱基，其单链 RNA 前体约70～90个碱基且具有发夹结构，经Dicer 酶加工后生成miRNA[14-16]。miRNA与靶 mRNA 的 3'UTR结合是通过碱基配对的方式，其翻译过程受到抑制而转录不被影响[17]。在细胞增殖凋亡、干细胞分化、发育以及各种疾病等生物学行为发生过程中均有靶 mRNAs的参与[18]。miRNA于机体血浆、血清中稳定存在，采用常规RNA萃取法即可获得，机体的生理、疾病状况等可通过检测血清样本中miRNA的种类、数目来反映，因此对miRNA的研究越来越广泛[19,20]。最初于斑马鱼中克隆得到的miR-221(hsa-miR-221)，后来依次于人类 HL-60 白血病细胞、老鼠神经元细胞中得到[21]。其成簇分布，转录形式为大顺反子，且基本上同步表达，位于X染色体p11.3区约1 kb区域内[22]。miR-221被证实在多种肿瘤细胞中表达上调，发挥促癌基因的作用；此外miR-221被敲除后可抑制小鼠血管平滑肌细胞增生以及血管内膜新生；此外有研究发现随着年龄的增长miR-221大量减少，进而引起其靶基因 P13K 增加，揭示 miRNA 及其靶基因的变化有望用于诊断人类老龄化疾病[23-26]。

本研究首先采用Aβ1-42诱导AD大鼠模型，然后分别将miR-221过表达慢病毒质粒及空载体质粒注射于AD大鼠尾静脉，同时设置不作任何处理的正常对照组。RT-qPCR检测4组大鼠血清中miR-221表达水平，结果显示正常对照组显著高于其他3组(P<0.05)，AD+miR-221过表达组高于AD组、AD+空载体组，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果表明Aβ1-42诱导AD大鼠模型成功，AD大鼠中miR-221表达水平显著降低，注射miR-221过表达慢病毒质粒后，miR-221表达水平升高，与预期相符。评价实验大鼠认知水平能力常采用水迷宫实验，其寻找安全逃生通道的空间认知能力以逃避潜伏期来反映，本研究表明经Aβ1-42诱导后大鼠逃避潜伏期显著延长，即认知功能显著下降，AD大鼠体内miR-221表达水平升高后，其逃避潜伏期明显缩短，认知功能得到提高，提示miR-221的表达与大鼠的认知功能呈正相关。作为大脑边缘系统的一部分，海马主要发挥学习与记忆功能，且是老年性痴呆最先遭受损伤的区域。为了进一步验证Aβ1-42诱导的老年性痴呆大鼠miR-221的表达与认知功能的关系，采用HE染色检测4组大鼠海马区及大脑皮层区神经元的病理变化，结果表明AD组均严重受损，AD+空载体组与其受损程度相近，AD+过表达组神经元损伤得到显著改善，且趋向于正常对照组。该结果进一步证实Aβ1-42具有神经毒性，可损伤大鼠海马区及大脑皮质神经元，导致细胞死亡进而诱发老年性痴呆，miR-221则可逆转老年性痴呆程度，间接说明miR-221可抑制老年性痴呆的发生。淀粉样前体蛋白(APP)作为A β的来源，是一种跨膜糖蛋白，依次在BACE1及γ-分泌酶作用下被裂解为各种长度的Aβ，聚集形成的沉积物即可形成脑内老年斑，其中胃蛋白酶家族的BACE1主要于神经细胞中表达。本研究采用Western-blot检测BACE1在大脑组织中的表达，结果显示Aβ1-42诱导后老年性痴呆大鼠大脑组织中BACE1蛋白表达量明显升高，而miR-221水平的升高抑制了BACE1的表达。提示BACE1可能是miR-221的靶基因，且miR-221对BACE1的表达发挥负向调控的作用。

综上，miR-221可能是通过降低BACE1的表达水平进而抑制Aβ1-42诱导的大鼠老年性痴呆，提高大鼠认知功能。今后miR-221有望作为进一步研究老年性痴呆临床检测及治疗的新靶标。