医用透明质酸钠凝胶的防粘连作用及对伤口愈合、抗生素作用的影响

蔡同凯,韩 华,曹永兵,3 *,阎 澜 *

(1.海军军医大学药学系，上海 200433；2.同济大学医学院，上海 200092；3.上海中西医结合医院脉管病研究所，上海 200082)

手术过程中发生创伤、细菌感染、异物残留等都会造成术后粘连的发生[1-2]。调查发现，几乎所有手术都涉及到术后粘连，一般腹腔、盆腔手术术后粘连率高达60%，其中开腹的腹腔、盆腔手术术后粘连发生率高达90%以上[2-5]。术后粘连会引起严重的并发症，导致患者出现肠道梗阻、盆腔炎、腹痛、不孕等症状，并且增加再次手术的难度，给患者带来严重的疾病痛苦和经济负担[1,2,5]。目前，增加屏障被认为是可以减少术后腹膜粘连的最有效的辅助手段。医用透明质酸钠凝胶(medical sodium hyaluronate gel，MSHG)为无色透明黏稠液体，主要成分为透明质酸钠。MSHG具有高分子纤维网状结构，可涂布于受伤组织表面并形成物理隔离层，能在损伤组织修复期间防止其与其他组织接触[1,6]，在临床广泛用于防粘连操作。然而，这种物理隔离是否会干扰术后愈合，或者这种屏障功能是否同样会影响体内抗生素的扩散却没有研究报道。有文献报道，透明质酸钠能被降解为多糖，为葡萄球菌等提供生长所需的营养[7]。因此，本研究通过建立大鼠盲肠和腹壁双侧损伤模型，考察术后涂抹MSHG是否具有防粘连作用，以及是否会对损伤肌肉组织的愈合产生影响，同时以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌，考察MSHG对细菌生长的影响以及对临床常用抗生素扩散的影响，从而为MSHG的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器 ALC-IP800LB微量注射泵(上海奥尔科特生物科技有限公司)；MD3000生理信号采集处理系统、50 N张力换能器(淮北正华生物仪器设备有限公司)；Sup G9型Supcre系列菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪(杭州迅数科技有限公司)；1510酶标仪(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 试药和细菌 MSHG(6 mg/ml，批号18061511，上海昊海生物科技股份有限公司)；阳性对照MSHG(10 mg/ml，批号18032012，上海建华精细生物制品有限公司)；戊巴比妥钠(批号2016071431，上海一基实业有限公司)；注射用头孢噻肟钠(批号EF5180702，华北制药河北华民药业有限责任公司)；左氧氟沙星注射液(批号18060831，扬子江药业集团有限公司)；硫酸庆大霉素注射液(批号81Y07031D1，宜昌人福药业有限责任公司)；注射用青霉素钠(批号180819，山东鲁抗医药股份有限公司)；注射用阿奇霉素(批号180807，东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；胰酪大豆胨琼脂培养基(杭州微生物试剂有限公司)；Mueller-Hinton 肉汤培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)。大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli，批号CMCC44102)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA，批号CMCC26003)由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 实验动物 50只SD大鼠(SPF级，批号20180006000780，上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，雌雄各半，动物合格证号：SYXK(沪)2018-0034。将大鼠饲养于同济大学沪北校区。

1.4 动物模型的建立 SD大鼠经适应性饲养后，按照区组随机数法分为假手术组、模型组(生理盐水0.30 ml/cm2)、低剂量组(MSHG 0.15 ml/cm2)、高剂量组(MSHG 0.30 ml/cm2)和阳性对照组(阳性对照MSHG 0.15 ml/cm2)，每组10只，雌雄各半。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹部剃毛，取腹部正中切口，逐层开腹，找到盲肠位置。假手术组将盲肠拉出伤口，暴露在空气中8 min后，将盲肠放回腹腔，逐层缝合伤口。其余各组在盲肠贴近腹腔壁一侧用一个1 cm×2 cm的窗口金属片压住，用灭菌纱布以同一方向摩擦大鼠盲肠约20次，使其呈针尖样出血为止，出血伤口面积约为1 cm×2 cm，同时在盲肠对应的腹壁位置损伤浅表面肌肉，创面面积约为1 cm×2 cm。将盲肠暴露在空气中8 min后，模型组涂抹生理盐水0.6 ml；低剂量组和高剂量组分别涂抹MSHG 0.3和0.6 ml；阳性对照组涂抹阳性药0.3 ml，然后将盲肠创面对着腹壁创面放回腹腔，再逐层缝合。

1.5 粘连评分 手术后30 d，将大鼠麻醉处死，“U”型开腹后观察大鼠腹腔粘连情况，包括脂肪与盲肠的粘连，脂肪与腹壁的粘连，盲肠与腹壁的粘连以及脂肪、腹壁和盲肠三者的粘连。以Nair粘连5级分类法对术后腹腔粘连严重程度进行评分，统计粘连发生率。0级：无粘连；1级：薄的薄膜状粘连；2级：多于1条薄膜粘连；3级：1处较厚的点状粘连；4级：存在厚的块状粘连。

1.6 极限荷载比和刚度比 手术后30 d，将大鼠麻醉处死，“U”型开腹后分别剪取腹壁损伤侧肌肉1 cm×2 cm和正常侧肌肉1 cm×2 cm，再在肌肉中间剪一个0.5 cm的缺口，以1.5 mm/s速率拉动肌肉，通过张力仪测定肌肉的极限载荷，用MD3000生理信号采集处理系统记录肌肉从拉伸开始到肌肉断裂的牵引时间，通过极限载荷比和刚度比来考察MSHG对损伤肌肉愈合的影响。极限载荷比是腹壁损伤侧肌肉与对应位置正常侧肌肉的最大张力的比值。刚度比是腹壁损伤侧肌肉与对应位置正常侧肌肉的刚度的比值。刚度=最大张力/(牵引速率×牵引至肌肉断裂的时间)。

1.7 棋盘稀释法考察细菌的体外生长 实验采用96孔板铺板，第2列仅加入Mueller-Hinton肉汤培养基作为空白对照，第11列加入菌液作为阴性对照，菌量为1×105cfu/孔。用倍比稀释法使第3列至第10列的MSHG终含量为50%、25%、12.5%、6.3%、3.1%、1.6%、0.8%和0.4%。阳性对照左氧氟沙星的初浓度为1 μg/ml。将96孔板置37 ℃培养箱中培养24 h，用酶标仪测定波长600 nm处的吸光度(A600)。

1.8 打孔扩散法考察MSHG对抗生素体外扩散的影响 本研究选择了临床上常用的5种抗生素，分别为头孢噻肟钠、左氧氟沙星、硫酸庆大霉素、青霉素钠及阿奇霉素。先用生理盐水配制一定浓度的抗生素储备液，其中头孢噻肟钠、左氧氟沙星、硫酸庆大霉素、青霉素钠及阿奇霉素的浓度分别为128、32、32、4、256 μg/ml，抗生素单用组用等量生理盐水稀释，抗生素联用MSHG组用等量的MSHG稀释，即抗生素的终浓度分别为64、16、16、2、128 μg/ml，MSHG的终浓度为3 mg/ml。采用打孔扩散法分别在相应孔中加入40 μl抗生素或抗生素与MSHG的混合物。将平板置37 ℃培养箱中培养24 h后，用Supcre系列菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪测量，计算每个抑菌圈的面积。

2 结 果

2.1 粘连程度 术后30 d， 处死各组大鼠， 以Nair粘连5级分类法进行腹腔粘连程度评分。 各组大鼠的腹腔粘连情况如图1所示。 假手术组中有1只大鼠出现薄膜状粘连； 模型组中9只大鼠均存在厚的块状粘连， 1只大鼠腹腔无粘连。各组大鼠的粘连评分见表1， 由表1可见， 假手术组、 低剂量组、 高剂量组、 阳性对照组和模型组的粘连评分均有显著性差异(P<0.001或P<0.05)。 因此， 认为MSHG能有效减轻腹腔粘连的程度， 降低粘连的损害。

2.2 极限荷载比和刚度比 各组大鼠的极限荷载比和刚度比见表1。假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组和阳性对照组，两组间相比均无显著性差异(P>0.05)，表明MSHG对创伤面的肌肉恢复无明显影响。

表1 腹腔手术后30 d各组大鼠的腹腔粘连情况、极限载荷比和刚度比Table 1 The abdominal adhesion rates and scores,ultimate load and stiffness of the muscles in the rats of each group 30 days after surgery (n=10，±s)

*P<0.05，***P<0.001，与模型组比较

2.3 对细菌体外生长的影响 空白培养基组未发现任何细菌生长，与阴性对照组相比，左氧氟沙星明显抑制了细菌的生长，抑菌效果具有剂量依赖性。MSHG与E.coli共培养24 h，随着MSHG浓度的增加，E.coli生长率逐渐降低。MSHG与SA共培养24 h，随着MSHG浓度的增加，SA生长率逐渐降低。因此，MSHG在不同浓度下对E.coli和SA的生长均无促进作用，相反在较高浓度下对两种菌胞生长有一定的抑制作用，见图2。

2.4 对抗生素体外扩散的影响 在培养基的孔中单独加入生理盐水，未见对E.coli和SA形成抑菌圈，而头孢噻肟钠、左氧氟沙星、硫酸庆大霉素、青霉素钠及阿奇霉素等抗生素均可形成明显的抑制圈。单独使用MSHG对E.coli和SA均未见抑菌圈的形成。结果表明，MSHG对E.coli和SA生长无明显抑制作用。头孢噻肟钠、左氧氟沙星、硫酸庆大霉素、青霉素钠及阿奇霉素对E.coli和SA的生长产生明显的抑制作用，均能形成抑制圈；而上述抗生素中加入MSHG后，E.coli和SA的抑菌圈面积无统计学差异(见表2)，抑菌圈大小均未发生显著的改变(见图3、图4)。由此可见，MSHG在体外未见影响实验用5种抗生素的药效。

表2 MSHG对5种常见抗生素抑菌圈面积的影响Table 2 The effect of MSHG on the antibacterial effect of five common antibiotics in the size of inhibition area (n=3，±s，A/mm2)

E.coli：大肠杆菌；SA：金黄色葡萄球菌；MSHG：医用透明质酸钠凝胶

3 讨 论

粘连是腹盆腔手术后最棘手的问题之一。感染和异物残留比创伤更容易造成术后粘连[8]，但创伤性粘连更贴近临床实际情况。创伤性粘连早期主要表现为纤维蛋白渗出的膜性粘连，纤维蛋白不断被纤维蛋白溶解酶溶解吸收，膜性粘连程度不断减轻，但未被溶解的纤维蛋白不断长入肉芽组织，纤维粘连不断增加，使得总的粘连程度在较长一段时间内维持在相对稳定的水平[1,2,9]。

本研究采用大鼠盲肠和腹壁双侧损伤模型，模拟临床的创伤性粘连。盲肠侧用灭菌纱布以同一方向摩擦大鼠盲肠约20次，使其呈针尖样出血，同时对应腹壁侧用剪刀刮掉浅表层肌肉。两侧同时损伤，建造严重的粘连模型。为了减小造模差异，实验采用带1 cm×2 cm窗口的薄金属片，控制每只大鼠的创面大小。假手术组1只大鼠盲肠与脂肪有薄膜状粘连，其余大鼠均未发生粘连。模型组除了1只大鼠未产生粘连，其余9只大鼠盲肠与腹壁间均有块状紧密粘连，同时伴随脂肪与盲肠和腹壁的粘连。模型组粘连率达90%，且均为最严重的块状紧密粘连。低剂量组和高剂量组的粘连率均为80%，盲肠与腹壁的粘连率分别为60%和50%，其中最严重的块状粘连率分别为40%和20%，其余均为粘连程度较轻的脂肪与盲肠或腹壁的薄膜状粘连；极限荷载比和刚度比与假手术组和模型组相比，均无统计学差异(P>0.05)。本研究结果验证MSHG能有效减轻粘连的程度，降低粘连的损害，同时对创面的愈合无影响。抗生素中加入MSHG后，E.coli和SA的抑菌圈大小均未发生明显改变，表明该浓度的MSHG不会影响抗生素的扩散。有研究认为透明质酸在体外能抑制SA等细菌的生长，并且浓度为1 mg/ml时就能达到最大抑制效果，但是没有杀菌作用[10-11]。本研究结果也证实了高于临床剂量的MSHG有抑制细菌生长的作用。