仙灵骨葆同方提取物的肝细胞毒性研究

蔺红伟，江春霞，陆文铨，朴淑娟

(海军军医大学长征医院药学部，上海 200003)

仙灵骨葆胶囊的处方由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄共6味中药材组成[1]。该制剂是一味相对成熟的中药成方制剂。近年来国内出现多起仙灵骨葆胶囊导致急性肝损伤的药品不良反应事件，导致其临床应用受到严重影响[2-4]，故针对该药的肝毒性研究具有重要临床意义。为了筛查出该药导致急性肝损伤的主要成分，不仅需要全方的胶囊制剂，更需要针对不同组成的缺方或单方制剂进行研究。故在仙灵骨葆胶囊企业标准的指导下[5-6]，作者所在的研究室制备了仙灵骨葆相同处方相同提取工艺的全方、缺方和各单方提取物，以肝细胞毒性为指标，评价该方剂及其中各种成分药对肝细胞的增殖抑制，初步阐释毒性成分，以期为前瞻性地发现其肝毒性和其他药品不良反应提供科学依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器 培养箱(美国Thermo Scientific公司)；超净台(上海上净净化设备有限公司)；取样枪(美国Gilson公司)；培养皿和试管(美国Corning公司)；显微镜(重庆重光实业有限公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；高压灭菌锅(日本Tomy Digital Biology公司)；96孔板(美国Corning Costar公司)；酶标仪(美国 BioTek公司)。

1.2 药品和试剂 淫羊藿(批号20140301)、续断(批号20140907)、丹参(批号20141010)、知母(批号20140701)、补骨脂(批号20140407)、生地黄(批号20140608)均购自河南铜陵和田中药饮片有限公司；人肝癌Hep3B细胞(中国科学院上海研究院细胞库)；专用培养基(MEM-1X，批号1616033)、0.25%胰酶冲洗液(Trypsin-EDTA-1X，批号20601113)、10%胎牛血清(批号1614021)、CCK-8试剂盒(批号1610023)均购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液(pH 7.4，批号E40205，上海博光生物科技有限公司)； FCCP(纯度>98%，批号370-86-5，美国Sigma公司)。

2 方法和结果

2.1 样品的制备 依照仙灵骨葆胶囊的处方配比，精密称取淫羊藿583.5 g、续断83.5 g、丹参41.5 g、知母41.5 g、补骨脂41.5 g、地黄41.5 g，制备全方提取物。(1)丹参药材粉碎成细粉，过筛，备用。(2)将淫羊藿、续断、知母、补骨脂药材粉碎成粗粉，地黄切成薄片。加水煎煮3次，第1次3 h，第2次2 h，第3次1 h，合并煎液，滤过，将滤液浓缩至相对密度为1．20(50 ℃)的清膏。(3)加入丹参细粉，混匀，干燥，得干膏。其他缺方和单方提取物，除丹参药材直接磨成细粉，过筛备用外，均按照上述(2)项方法分别制备。

2.2 溶液的配制 (1)全方或缺方样品溶液：分别精密称取全方提取物72.46 mg、缺淫羊藿提取物76.30 mg、缺续断提取物76.74 mg、缺丹参提取物76.78 mg、缺知母提取物77.94 mg、缺补骨脂提取物72.57 mg、缺地黄提取物77.56 mg，加10% 二甲亚砜(DMSO) 5 ml，超声提取60 min，分别用配制好的培养液稀释成梯度浓度的全方或缺方样品溶液。(2)单方样品溶液：精密称取淫羊藿提取物64.11 mg、续断提取物51.73 mg、丹参提取物113.69 mg、知母提取物63.41 mg、补骨脂提取物16.02 mg、地黄提取物40.26 mg，分别置10 ml离心管中，各加10%DMSO 1 ml，超声提取60 min，用配制好的培养液稀释成5 ml溶液，再分别用培养液稀释成梯度浓度的单方样品溶液。(3)阳性对照样品溶液：精密称取阳性对照药FCCP 0.74 mg，置10 ml容量瓶中，加1 ml DMSO溶解，再用配制好的培养液稀释至刻度，于4 ℃储存。

2.3 细胞毒性实验 取对数生长期的Hep3B细胞[7]，以1×105个/孔(每孔100 μl)接种于96孔板上，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，待24 h细胞完全贴壁。按照样品组、空白对照组、溶媒组和阳性对照组分别加入相应的样品溶液各10 μl，培养箱中培养48 h后，每孔分别加入CCK-8试剂10 μl，再放入培养箱中培养2 h，用酶标仪在450 nm下测定吸光度(A)。计算细胞存活率，细胞存活率(%)=(A样品-A空白对照)/(A溶媒-A空白对照)×100%。用GraphPad Prism 6软件计算细胞毒性体外模型的半数抑制浓度(IC50)值。

2.4 全方和各缺方提取物的IC50值 本研究得到全方和各缺方提取物作用下的细胞存活率,见表1。进一步通过阳性对照药物FCCP[7]验证该细胞模型并获得量效参考值，测得全方提取物、缺淫羊藿提取物、缺续断提取物、缺丹参提取物、缺知母提取物、缺补骨脂提取物和缺地黄提取物的IC50值分别为153.2、312.2、217.1、256.5、229.6、246.9和259.4 μg/ml。由此可见，全方提取物的IC50值明显较低，表明该处方在临床应用阶段表现出来的肝毒性是有一定的物质基础的，同时也提示该制剂中存在可能导致肝毒性的成分，有必要对其进行筛选。各缺方提取物IC50差异不显著，但是和溶媒组进行对比，已表现出非常明确的细胞毒性，需要通过对各单方提取物的细胞毒性进一步确认，才可以明确仙灵骨葆的肝毒性物质。

2.5 各单方提取物的IC50值 本研究进一步考察了各单方提取物作用下的细胞存活率，见表2，并计算相应的IC50值。测得淫羊藿提取物、续断提取物、丹参提取物、知母提取物、补骨脂提取物和地黄提取物的IC50值分别为91.77、179.0、410.6、307.9、73.22和180.2 μg/ml。结果表明，淫羊藿提取物和补骨脂提取物的IC50值明显低于其他成分提取物，说明仙灵骨葆处方中这两味药是引发肝毒性的主要成分，需要针对这两味药的肝毒性做进一步研究，明确了后续研究的方向。

表1 不同浓度的仙灵骨葆全方和缺方提取物的肝细胞毒性Table 1 Hepatotoxicity in different concentrations of Xianling Gubao extract and its ingredients omission extracts (n=6，±s)

3 讨 论

本研究从细胞层面对仙灵骨葆全方、各缺方和相应单方的肝毒性进行了研究，发现淫羊藿和补骨脂是仙灵骨葆产生肝细胞毒性的主要成分。这为后续仙灵骨葆处方中毒性物质的筛选明确了方向，可以针对淫羊藿和补骨脂这两个单方提取物进行深入研究。关于补骨脂造成肝损伤的案例已有相关报道[8]，并且也有了大量相关的肝毒性研究。周昆等[9]发现补骨脂的主要活性成分异补骨脂素作用于HepG2 细胞24 h 后，其IC50值为118.1 μmol/L，证实了补骨脂的肝细胞毒性。但是关于淫羊藿肝细胞毒性的相关数据尚未得到大量的文献支持，仍需更多的实验加以确证。本研究通过体外实验筛选出仙灵骨葆处方中的主要毒性成分，为后续的体内药物毒性研究打下了基础，也为指导仙灵骨葆胶囊的临床合理用药提供了实验依据。

表2 不同浓度的仙灵骨葆各单方提取物的肝细胞毒性Table 2 Hepatotoxicity in different concentrations of each single extract of Xianling Gubao (n=6，±s)