超高分子量聚乙烯诱导小鼠植骨气囊骨溶解模型的构建

董子漾， 赵江博， 马 宁， 蔡乐琪， 刘玲玲， 陈德胜

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院骨科，银川 750004）

人工关节置换术是目前公认的治疗晚期骨性关节炎、股骨头坏死等疾病的有效方法，可以达到消除疼痛、矫正畸形、改善功能的目的，大大提高了患者的生活质量。随着关节置换患者的增多，假体晚期无菌松动的问题日益凸显，二次翻新治疗给广大患者无论是经济还是精神上都带来严重的创伤。因此通过非手术方式来预防和治疗人工关节置换术后发生的无菌性松动一直是关节外科的研究热点。目前研究[1]发现，导致无菌性关节松动的原因可以分为物理因素和生物因素，其中物理因素与手术操作等有关，而生物因素则是由于磨损颗粒的作用。本实验利用超高分子量聚乙稀（UHMWPE）颗粒，将磨损颗粒诱导骨溶解模型和植骨气囊模型相结合，模型构建完成后，进行大体及病理学染色观察，为研究假体周围骨溶解引起的无菌性松动建立更加经济、有效地贴近临床的动物模型，为进一步的临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

UHMWPE 颗粒（购自西安润德生物技术有限公司）；苏木精-伊红染液、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒（购自西安润德生物技术有限公司）；Masson 丽春红酸性复红液；4%多聚甲醛、叔丁醇、12.5% EDTA、无水乙醇、PBS 液（购自银川润研生物技术有限公司）；3% H2O2；RANK 抗体（购自Abcam 公司）；山羊抗兔IgG（购自北京中杉金桥公司）；蒸馏水，二甲苯，Olympus 显微镜、真空烘箱、石蜡包埋机、石蜡切片机，Salfradent 离心加速机，Leica Q-500 图像分析仪（购自博士德生物工程有限公司）。

1.2 实验动物

雌性SPF 级BALB/c 小鼠，30 只，健康状况良好，平均8～10 周龄。5 只/笼饲养于宁夏医科大学实验动物中心SPF 级动物房。

1.3 模型制备

30 只雌性BALB/c 小鼠，其中10 只处死后取颅骨骨片，去除骨片周围软组织后备用。另外20 只小鼠随机分为空白对照组和UHMWPE 颗粒刺激组，每组10 只。两组小鼠分别行气囊形成术，即第1 天在小鼠背部皮下注射无菌空气2 mL，此后每天在同一部位向气囊内注射无菌空气1 mL，直至第7 天气囊形成。第8 天，分别切开两组小鼠背部的气囊，向其中植入颅骨骨片并缝合切口，制成植骨气囊模型。空白对照组小鼠植骨后气囊内立即注射0.3 mL 无菌PBS 液，UHMWPE 颗粒刺激组小鼠立即注射0.3 mL UHMWPE颗粒（5 mg）。第14 天，处死两组小鼠，取出空白对照组和UHMWPE 颗粒刺激组气囊内的颅骨骨片及其周围包裹的囊壁组织，进行大体观察以及病理学染色观察[2]。

1.4 病理标本的制备

对取出的颅骨及气囊壁组织置于12.5% EDTA 脱钙液中脱钙2 周；脱水、二甲苯透明处理后，再将标本浸于石蜡包埋，分组标记。将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4 μm。切片漂浮于摊片机40 ℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60 ℃烘箱内烤片，待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。分别进行HE 染色、Masson 与免疫组织化学双染法、TRAP 染色，比较UHMWPE 颗粒刺激组与空白对照组炎性细胞数目、气囊壁厚度、破骨细胞数目的差异。

1.5 HE 染色行炎性细胞计数

取颅骨及其囊壁组织固定，石蜡包埋，制成切片，用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木精染色、水洗，盐酸乙醇分化、水洗，氨水返蓝、水洗，伊红染色、水洗，又经乙醇、二甲苯脱水透明后树脂封固。

对标本各随机采集10 个视野，采用Olympus DP70 显微镜系统（购自日本Olympus 公司）拍摄照片，图像采用Image Pro Plus 5.0 软件（购自美国Media CyberneTics 公司）分析，计算UHMWPE 颗粒刺激组与空白对照组的炎性细胞数目（个/mm2）平均值。

1.6 利用Masson 与免疫组织化学双染法测量气囊壁厚度

将上述石蜡切片脱蜡，铬化处理后，用蒸馏水冲洗，首先进行免疫组化染色：3%H2O2封闭内源性过氧化物酶（室温避光，10 min），蒸馏水洗5 min（2 次），抗原修复，PBS 液5 min（2 次），从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分，滴加正常山羊血清处理（37 ℃，15 min），滴加RANK 抗体（37 ℃，2 h），再次PBS液5 min（2 次），滴加山羊抗兔IgG（37 ℃，40 min），PBS 液5 min（2 次），DAB 显色，镜下观察，蒸馏水充分冲洗后苏木精复染（室温，30 s），冲洗返蓝（15 min），梯度酒精脱水，二甲苯透明处理。

在免疫组化染色的基础上再进行Masson 套染：先用Regaud 苏木精染液染核5～10 min，经充分水洗后，再用Masson 丽春红酸性复红液5～10 min。分别以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钼酸水溶液分化3～5 min。不经水洗，直接用苯胺蓝染5 min。再以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，最后用中性树胶封片[3]。标本摄片后利用软件分析（方法同上），测量气囊壁厚度（μm）。

1.7 利用TRAP 染色行破骨细胞计数

首先将切片脱蜡，依据美国Genmed scientifics 公司TRAP 染色试剂盒说明书顺序进行，最后进行脱水封片。

标本摄片后利用软件分析（方法同上），对颅骨组织行破骨细胞计数，并分别计算每高倍镜（×40）视野下UHMWPE 颗粒刺激组与空白对照组的破骨细胞数平均值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两个独立样本的t检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

手术切开背部气囊壁，进行大体观察，可见UHMWPE 颗粒刺激组中囊壁组织明显充血水肿，且囊壁较厚，空白对照组中囊壁组织未见明显水肿，囊壁光滑且较薄。

2.2 两组小鼠炎性细胞计数比较

UHMWPE 颗粒刺激组可见骨小梁结构紊乱，有明显的骨溶解现象及炎症反应过程，可见大量胞核深染的炎性细胞；空白对照组骨溶解现象不明显，骨小梁结构规则，炎性细胞较少（图1）。经过细胞计数，UHMWPE 颗粒刺激组炎性细胞（7565.45±285.94）（个/mm2）多于空白对照组的（6017.95±184.02）（个/mm2）（t=-20.35，P＜0.001）。

2.3 两组小鼠气囊壁厚度比较

UHMWPE 颗粒刺激组颅骨及囊壁组织内可见较多被染成棕色的RANK 蛋白，提示破骨细胞大量增殖活化，骨溶解过程发生；而空白对照组上述表现不明显（图2）。UHMWPE 颗粒刺激组气囊壁的厚度［（186.85±24.30）μm］大于空白对照组［（157.75±17.56）μm］（t=-4.34，P＜0.001）。

2.4 两组小鼠破骨细胞计数比较

图3 可见被染成酒红色的破骨细胞，每高倍镜（×40）视野下UHMWPE 颗粒刺激组破骨细胞计数［（15.25±1.86）个］多于空白对照组［（2.55±0.94）个］（t=-27.22，P＜0.001）。

3 讨论

1999 年Merkel 等[4]首先使用磨损颗粒诱导骨溶解的颅骨模型，2004 年Ren 等[5]首先采用小鼠气囊模型来进行人工关节无菌性松动的研究。目前的骨溶解模型主要包括磨损颗粒诱导骨溶解模型和植骨气囊模型，但两者均存在各自的局限性。本实验将上述两种模型进行有机结合，既保留气囊模型对软组织的良好模拟效果，又便于发挥磨损颗粒的诱导作用，并且最终通过大体观察、HE 染色、Masson 与免疫组织化学双染、TRAP染色四种方法综合评价模型构建的效果。

既往磨损颗粒的选择以钛颗粒为主，本模型选用UHMWPE 颗粒来模拟人工假体关节面之间所产生的磨损颗粒，UHMWPE 具有优良的生物相容性、耐腐蚀性，更重要的是目前正广泛应用于临床人工关节假体植入术[6-8]。

UHMWPE 颗粒可刺激气囊壁的界膜组织增生，并被巨噬细胞吞噬，刺激其释放一系列的细胞因子，激活RANKL/RANK 等信号通路，促进破骨细胞的产生与成熟，促使成骨细胞增殖能力减弱甚至凋亡，从而诱导骨溶解以及无菌性松动的发生。

模型构建完成后，将气囊组织切开，可见颅骨组织被界膜组织形成的囊壁以及皮肤和皮下组织所包裹，对取出的气囊壁和颅骨组织进行大体观察，可见UHMWPE 颗粒刺激组颅骨周围囊壁组织较空白对照组明显充血水肿，且囊壁较厚，提示有炎症反应过程。HE 染色中，UHMWPE颗粒刺激组内可见大量炎性细胞浸润，且骨小梁结构不规则，有明显的骨溶解现象，通过对炎性细胞进行计数，发现UHMWPE 颗粒刺激组多于空白对照组；Masson 与免疫组化双染法可发现UHMWPE 颗粒刺激组内存在较多被染成棕色的RANK 蛋白，表明RANKL/RANK 通路被激活，破骨细胞大量增殖与分化及其数量明显增多，且测得UHMWPE 颗粒刺激组内气囊壁厚度大于空白对照组；TRAP 染色可以将破骨细胞染成酒红色，UHWMPE 刺激组内的破骨细胞数也多于空白对照组。提示UHMWPE 颗粒刺激组炎细胞广泛增殖、破骨细胞分化成熟、气囊壁界膜组织增生，发生了骨吸收过程与慢性炎症反应，与临床上无菌性松动的病理生理过程相契合，进而可以证明UHMWPE 诱导小鼠植骨气囊骨溶解模型基本构建成功[9-13]。

当然此模型仍具有一些不足，首先，UHMWPE 材料磨损颗粒密度低，不易调配成均匀的混合液。其次，本模型仅仅模拟了病理状态下磨损颗粒对骨溶解的诱导作用，但对于其他物理生物因素缺乏严谨全面的阐述[14-15]。

虽然具有上述的局限性，但本模型成功地将植骨气囊模型与磨损颗粒诱导骨溶解模型相结合，并且引入了UHMWPE 材料模拟磨损颗粒，通过大体观察以及三种病理染色来评价模型构建的效果，较之前的模型更加经济、有效地模拟了临床上人工假体的无菌性松动。