益肾通癃胶囊对良性前列腺增生大鼠模型COX-2 及PGE2 表达的影响

周 欢，羊 羡，李 博，赵文雪，罗星乐，张 彪，苗润泽，胡 伟，涂雅玲，陈其华

（1．湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙410208； 2．湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

良性前列腺增生症（Benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性常见的泌尿系统疾病之一，该病进展缓慢，主要以下尿路症状为主，如尿频、尿急、排尿困难及夜尿次数增多等排尿前症状，尿等待、尿线变细、排尿无力等排尿期症状以及排尿不尽、尿后滴沥等排尿后症状，严重影响患者生活质量。因此，对BPH 的积极防治和改善患者的生活质量均具有重要意义。BPH 发病机制目前尚不明确，近年来炎症在BPH 的发生和发展过程中的重要作用已逐渐引起关注［1-4］。有研究证实，与环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）相关联的炎症系统参与了BPH 的发生与发展［5-6］，并与前列腺癌的发病密切相关［7］。故从COX-2 及相关通路入手，探讨BPH 的发病机制及干预方法，将病变控制在BPH 初期阶段甚至彻底治愈具有重要的临床价值。导师陈其华教授在临床研究中发现，经验方益肾通癃胶囊对BPH 有较好的治疗效果。本实验通过观察益肾通癃胶囊对BPH 模型大鼠前列腺组织内COX-2 及PGE2表达的影响，探究其治疗良性前列腺增生的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF 级SD 大鼠80 只，体质量（250±20）g，8 周龄，由湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证：SCXK（湘）2014-0002。饲养于湖南中医药大学第一附属医院动物实验中心，实验前将动物适应性驯养1 周。本研究所有动物实验经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.1.2 实验试剂 益肾通癃胶囊（湖南中医药大学第一附属医院制剂中心生产，生产批号201306060）；塞来昔布胶囊［Pfizer Pharmaceuticals LLC/辉瑞制药有限公司分装（英国/中国分装），进口药品注册标准JX20000001，国药准字J20120063］；癃闭舒胶囊（石家庄科迪药业有限公司，国药准字Z10960007）；丙酸睾丸酮注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号1104161，规格25 mg/mL/支×10 支/盒），使用时溶于橄榄油中；橄榄油（西班牙生产，规格500 mL/瓶），作为丙酸睾丸酮的溶媒；RNA 提取液

trizo（lInvitrogen，货号15596018）；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TAKARA，RR036A）；SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（TAKARA，RR820A）；COX-2 及PGE2引物由生

工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 实验仪器 电子分析天平；台式高速冷冻型微量离心机（Eppendorf，5424R）；荧光定量PCR仪（ABI，7500）；超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司，仪器型号SW-CJ-1FD）；超微量分光光度计（Thermo，Nano Drop2000）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药 将80 只雄性SPF 级SD 大鼠适应性喂养1 周后随机分为8 组，每组10 只，分别为空白组、假手术组、模型组、癃闭舒组、塞来昔布组，益肾通癃低、中、高剂量组。空白组不做任何处理，假手术组切除双侧睾丸，其余各组采用双侧睾丸切除术联合经背皮下注射丙酸睾酮复制BPH 大鼠模型。造模成功后，空白组、假手术组及模型组予生理盐水10 mL/（kg·d）灌胃，癃闭舒组予癃闭舒溶液0.24 g/（kg·d）灌胃，塞来昔布组予塞来昔布溶液0.02 g/（kg·d）灌胃，益肾通癃低、中、高剂量组分别予益肾通癃溶液0.24 g/（kg·d）、0.48 g/（kg·d）、0.96 g/（kg·d）灌胃。连续灌胃12周。

1.2.2 检测指标

1.2.2.1 前列腺湿重及前列腺指数（PI） 末次给药24 h 后（禁食不禁水12 h），大鼠称重后迅速脱颈椎处死，剖腹仔细分离后摘取前列腺，去除附带的结缔组织，用滤纸吸干前列腺组织表面的液体，随后称取湿重，计算PI。PI=前列腺湿重（mg）/小鼠体质量（g）。

1.2.2.2 COX-2 及PGE2mRNA 表达 取匀浆管，加入1 mL 的Trizol Reagent，置冰上预冷，取100 mg组织，加入匀浆管中，充分研磨直至无可见组织块，12 000 rpm 离心10 min 取上清，加入250 μL三氯甲烷，颠倒离心管15 s，充分混匀，静置3 min，4 ℃下12 000 rpm 离心10 min，将上清转移至新的离心管中，加入0.8 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃放置15 min，4 ℃下12 000 rpm 离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA。吸除液体，加入75%乙醇1.5 mL 洗涤沉淀，4 ℃下12 000 rpm离心5 min，将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3 min，加入15 μL 无RNA 酶的水溶解RNA，55 ℃孵育5 min。用逆转录试剂盒将总mRNA 逆转录为cDNA 后进行扩增，PCR 仪的反应条件为95 ℃，10 min，95 ℃，15 s→60 ℃，60 s，反应共进行40 个循环，于65 ℃～95 ℃绘制溶解曲线。

1.2.2.3 前列腺组织炎症浸润情况 取前列腺组织固定于10%多聚甲醛溶液中，予常规乙醇脱水、石蜡包埋、切片、HE 染色，在光镜下观察各组大鼠前列腺组织内炎症浸润情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学处理，所有数据均以均数±标准差（±s）表示，组间比较若满足正态性且方差齐时采用单因素方差分析，采用LSD法和SNK法，方差不齐时选择Tamhane T2和Dunnett T3法进行方差检验和两两比较，若不满足正态性时采用秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠前列腺湿重与PI 值比较

假手术组大鼠前列腺湿重及PI 值与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05），其余组别大鼠前列腺湿重及PI 值均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，癃闭舒组、塞来昔布组、益肾通癃低、中、高剂量组大鼠前列腺湿重及PI 值均明显降低（P＜0.05），尤以塞来昔布组及益肾通癃中剂量组降低最显著（P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠前列腺湿重及PI 值比较 （x±s）

2.2 各组大鼠前列腺组织中COX-2 及PGE2 mRNA表达的比较

与空白组比较，假手术组大鼠前列腺组织COX-2、PGE2mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.05），其余组别大鼠前列腺组织COX-2、PGE2mRNA 表达均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，癃闭舒组、塞来昔布组、益肾通癃低、中、高剂量组大鼠前列腺组织COX-2、PGE2mRNA 表达均明显降低（P＜0.05），尤以塞来昔布组及益肾通癃中剂量组降低最显著（P＜0.01）。结果见表2 及图1。

表2 各组大鼠前列腺组织中COX-2 及PGE2 mRNA 表达比较（x±s）

2.3 各组大鼠前列腺组织炎症浸润情况比较

空白对照组及假手术组大鼠前列腺组织内未见有明显炎性细胞浸润；模型组大鼠前列腺组织内可见大量炎症细胞浸润；癃闭舒组、益肾通癃低剂量组及高剂量组大鼠前列腺组织内可见部分炎症细胞浸润；塞来昔布组及益肾通癃中剂量组大鼠前列腺组织内可见少量炎症细胞浸润。结果见图2。

3 讨 论

图1 各组大鼠前列腺组织中COX-2 及PGE2 mRNA 表达

BPH 属中医“精癃”“癃闭”范畴。《灵枢·本输》：“三焦者，……实则闭癃，虚则遗溺，遗溺则补之，闭癃则泻之。”多数医家认为BPH 以本虚标实为总的病机，本虚以肾虚、脾虚为主，标实则以痰浊、瘀血居多［8-9］。本病多见于中老年男性患者，病位在精室。脾肾亏虚，命门火衰，下元虚寒，气化不足，开合失司则致癃闭；久病多瘀，气虚推动无力，气滞血行不利，日久则成瘀，结于下焦，故肾虚血瘀是其主要病机。益肾通癃胶囊方中补骨脂、黄芪共为君药，以补肾益气；五灵脂活血散瘀；山药、山茱萸、熟地、枸杞子滋补肾阴，寓阳中有阴，阴中有阳之意；金樱子固精缩尿；茯苓健脾；甘草调和诸药。全方共奏补肾益气，化瘀缩尿之功效，目前已在临床使用中获得较好疗效［10］。

图2 各组大鼠前列腺组织炎症浸润情况

近年来，关于炎症与BPH 发病的研究日趋增多［11-13］，慢性炎症反应作为BPH 疾病进程中的主要致病因素已经得到了证实，有学者研究发现BPH 样本在组织学检查中均显示有炎症细胞浸润［14］。COX-2 是一种诱导型酶，目前已被证实是慢性炎症发生的关键成员，生理状态下其在绝大部分组织细胞中均不表达，当细胞受到炎性介质、细胞因子、生长因子、癌基因产物或致癌剂等因素刺激作用时，在细胞内呈表达增高趋势，参与多种病理生理过程。有研究证实，与COX-2 相关联的炎症系统参与了BPH 的发生与发展［15］，部分药物对BPH 的治疗是通过抑制COX-2 及相关炎症蛋白的表达而实现［16-17］。PGE2在机体内分布广泛，通过与下游的4 种受体结合，激活了众多具有增生、凋亡、迁移、血管新生作用的通路，是许多增生性疾病乃至癌症重要始动和转移环节［18］。有研究表明，PGE2的表达水平与前列腺体积呈正相关，同时PGE2含量与炎症的严重程度密切相关［19］。

本实验通过双侧睾丸切除术联合经背皮下注射丙酸睾酮复制前列腺增生大鼠模型，造模成功后探究不同药物对模型大鼠前列腺组织内COX-2 及PGE2的影响。研究结果表明，益肾通癃胶囊可明显降低良性前列腺增生大鼠前列腺组织的前列腺湿重及前列腺指数，下调COX-2 及PGE2表达，减轻前列腺组织的局部炎症浸润情况。综上所述，益肾通癃胶囊对前列腺增生大鼠模型炎症反应具有很好的改善作用，其机制可能与抑制COX-2 及PGE2受体表达水平有关，益肾通癃胶囊在前列腺增生患者治疗中的作用及其良好的抗炎作用得到充分证实，为进一步研究开发提供了一定的支持。