黄芪桂枝五物汤对阳虚寒凝型骨关节炎疼痛作用的实验研究

孙力威，周文静，赵子苇，赵 乐，靳 荃，李艳彦，，阴倩雅，罗 敏

（1.山西中医药大学基础医学院，山西 晋中030619； 2.山西中医药大学第二临床学院，山西 晋中030619；3.北京中医药大学，北京100029）

骨关节炎（OA）是一种老年人常见的退行性关节疾病，临床以关节酸痛、僵硬、肿胀，活动或久坐后疼痛加重为主要表现，其中疼痛是导致患者步行障碍的重要原因，严重影响到患者的正常生活。目前以药物关节内注射、口服西药、关节置换术为主的西医疗法［1-2］存在成本较高及疗效欠佳的不足，难以于疼痛缓解方面取得确切的疗效［3-4］。中医认为，骨关节炎属于“骨痹”，与寒湿侵袭人体经脉关节，阻滞气机，影响血行，不通则痛关系密切［5］。黄芪桂枝五物汤是《金匮要略》中治疗“痹症”的经典方剂［6］，在临床上对骨关节炎痹症疼痛的治疗有很好的疗效［7］。本研究在临床上黄芪桂枝五物汤治疗骨关节炎痹症疼痛有效性的基础上，从缓解疼痛的角度对其作用机制进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雌性8 周龄Sprague Dawley（SD）大鼠54 只，体质量（200±10）g，北京维通利华实验动物中心提供，合格证号SCXK（京）2016-0006，室温（19±2）℃，湿度40%～70%，自然昼夜节律。

1.1.2 药物及试剂 黄芪桂枝五物汤诸药由同仁堂药店提供，药材以《金匮要略》［8］原书用量，按照人体与大鼠体表面积折算实际用量，分2 次煎煮，煮后将2 次药液合并，分别浓缩至含生药量为2.91 g/kg，5.85 g/kg，11.7 g/kg，冰箱保存备用，塞来昔布胶囊（辉瑞制药有限公司，国药准字J20140072，0.2 g/片），白介素-1（IL-1）、白介素6（IL-6）、P 物质（SP）、5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（武汉华联科生物技术有限公司，批号201902），环氧合酶-2（COX-2）、多巴胺（DA）、神经生长因子（NGF）、5-羟色胺（5-HT）、P 物质（SP）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海西塘生物科技有限公司）

1.1.3 实验仪器 352 型酶标仪：（芬兰Labsystems Multiskan MS 公司产品），AC-8 洗板机：（芬兰Thermo Labsystems 公司产品），TG16W 离心机：（安徽中科中佳科学仪器有限公司），GNP-9080培养箱：（中国Heal Force 公司），BCD-206STPQ冰箱（产自青岛海尔股份有限公司），MGC-350HP气候箱（产自上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 按照随机数字表法将54 只SD 大鼠分为正常组（9 只）和造模组（45 只），大鼠冷固法复制骨关节炎模型［5］。造模成功后，将造模组大鼠随机分为模型组，黄芪桂枝五物汤高、中、低剂量组，塞来昔布组，每组9 只。

1.2.2 造模与给药 除正常组外，其余大鼠采用石膏固定、冰水站立、隔日禁食及外界环境刺激，制备阳虚寒凝型骨关节炎疼痛模型［5］，每日上午将5 组大鼠双下肢石膏固定，下午将大鼠放入没过大鼠膝关节的冰水站立6 h，并保持水温在（6±0.5）℃；6 h 后，将大鼠放入气候箱，温度4 ℃，湿度50%，时长8 h，持续6 周。同时，从造模第1 周开始，各组大鼠予隔日禁食（饮水不限），造模结束后恢复正常室温（18±2）℃。

造模结束后黄芪桂枝五物汤按照《金匮要略》［8］中的比例配伍，每周按大鼠体质量煎药。按照人体与大鼠体表面积折算实际用量。煎药前先将药材浸泡30 min，分别用10 倍水和8 倍水煎煮2 次，最后用纱布过滤，将滤液合并浓缩至分别含生药量为2.93 g/kg，5.85 g/kg，11.7 g/kg。塞来昔布药粉温水溶至浓度为18 mg/kg，正常组和模型组灌胃给予同等剂量生理盐水。

1.3 指标检测

观察大鼠一般状态。血清的指标检测：灌胃结束后次日，麻醉后，取大鼠腹主动脉血，3000 r/min离心30 min 分离血清，ELISA 法检测血清中IL-1、IL-6、SP、5-HT、DA 含量。大脑匀浆的指标检测：取大鼠大脑，匀浆后以ELISA 法检测匀浆液中COX-2、DA、NGF、5-HT、SP 含量，组织稀释比例为1∶9。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析，所有数据资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用One-way ANOVA单因素方差分析，多组间比较采用LSD-t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况

造模结束后，观察各组大鼠一般状态。正常组大鼠皮毛光泽、柔顺，色白，纳食如常，活动未受限；模型组大鼠精神疲倦，活动少，毛色较正常组暗淡，无光泽，不柔顺，进食减少，均见便溏，双下肢可见明显肿胀、溃破，活动不灵活，有跛行，尾部有明显的瘀痕；黄芪桂枝五物汤中、高剂量组和塞来昔布组大鼠毛色较模型组有光泽，大便较模型组成形，双下肢活动轻微受限，无跛行，尾部未见明显瘀痕；黄芪桂枝五物汤低剂量组大鼠少动，皮毛不光泽，便溏较模型组少，双下肢肿胀，肢体活动不利，有跛行，尾部粗大瘀痕较模型组轻。

2.2 黄芪桂枝五物汤对骨关节炎大鼠模型血清IL-1、IL-6、SP、5-HT、DA、COX-2 水平的影响

与正常组比较，模型组IL-1、IL-6、SP、5-TH、DA、COX-2 含量显著增高（P<0.01，P<0.05），差异有统计学意义；与模型组比较，塞来昔布组，低、中、高剂量组IL-1 显著降低（P<0.01，P<0.05），差异有统计学意义。各用药组大鼠DA、IL-6、5-TH含量均显著降低（P<0.01），差异有统计学意义。阳性对照组、高剂量组SP 含量显著降低（P<0.01），低、中剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义。阳性对照组，低、中、高剂量组COX-2 显著降低（P<0.01，P<0.05），差异有统计学意义。结果见表1。

表1 黄芪桂枝五物汤对OA 血清IL-1、IL-6、SP、5-HT、DA 含量的影响 （x±s）

表2 黄芪桂枝五物汤对匀浆COX-2、DA、NGF、5-HT、SP 含量的影响 （x±s）

2.3 黄芪桂枝五物汤对骨关节炎大鼠模型大脑COX-2、DA、NGF、5-HT、SP 水平的影响

与正常组比较，模型组COX-2、DA、5-HT、SP含量均增高（P<0.01），NGF 显著增高（P<0.05），差异有统计学意义；与模型组比较，阳性对照组，中、高剂量组COX-2 显著降低（P<0.01），低剂量组显著降低（P<0.05），差异有统计学意义；各用药组NGF 指标含量有降低趋势，但差异无统计学意义；中、高、低剂量组，塞来昔布组5-HT 显著降低（P<0.01，P<0.05），差异有统计学意义，阳性对照组，中、高剂量组SP 显著降低（P<0.01），差异有统计学意义，低剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义。结果见表2。

3 讨 论

骨关节炎以关节酸痛、僵硬、肿胀、活动或久坐后疼痛加重为主要临床表现，其中，疼痛是迫使患者就医、影响患者生活工作的重要原因。黄芪桂枝五物汤具有益气温阳散寒等功效，在临床治疗骨关节炎疼痛中疗效确切［9］，本方中黄芪、桂枝均具有抗炎、镇痛、抗血小板聚集的作用，临床研究中，黄芪桂枝五物汤加味对产后身痛［10］、带状疱疹后遗神经痛［11］、膝骨性关节炎疼痛［12］等有确切的止痛效果，但其单独治疗疼痛的文献研究较少，课题组以黄芪桂枝五物汤有效治疗“痹症”疼痛的临床经验为基础［7］，结合前期研究，复制骨关节炎大鼠模型［13］，从炎症因子和疼痛因子入手，探求黄芪桂枝五物汤对骨关节炎疼痛的影响，以进一步发现其止痛机制。

近年来研究发现，炎性细胞因子及神经递质与疼痛有着密切的联系，炎症、疾病及外伤均易导致组织损伤，从而向细胞外液中释放一些内源性化学物质引起疼痛，这些物质统称为致痛物质［14］。炎性细胞可以促进炎性细胞因子的渗出和趋化，激活炎性细胞，引起发热反应，参与炎症损伤。与炎性痛相关的IL-1、IL-6 及趋化因子COX-2 在皮内注射后会产生机械性或热性痛敏表现。动物实验表明，末梢和中枢敏化参与了OA 疼痛，其中涉及炎性细胞因子、神经肽和各种化学介质、脑干的下行性易化系统［15］。骨关节炎发生时，一定强度的伤害性刺激作用于外周感受器，随后通过神经冲动循感觉传导通路传入中枢神经，经脊髓等中继后作用于大脑边缘系统和大脑皮质，然后通过各级中枢处理后产生骨关节疼痛感觉与反应［16］。由于OA 主要作用于膝关节组织，这些组织的神经末梢也会受到病理生理学影响，发生神经病理性改变，出现机械性和热刺激阈值降低，以及牵涉疼痛，表明存在末梢和中枢神经系统的异常兴奋和传导。上述研究表明，OA 疼痛的发生同炎性细胞因子及神经性细胞因子的相互作用密切相关。

在炎性因子方面，IL、COX-2 均参与疼痛的发生，其中COX-2 发挥着更为重要的作用。环氧化酶（COX）主要有两种，COX-1 和COX-2，在炎性介质和细胞因子IL-1 刺激下，COX-2 发挥作用，并在IL-8 的调控下，COX-2 的表达显著增加，炎症反应加剧。COX-1 和COX-2 合成前列环素（PG），可直接作用于伤害性感受器产生疼痛，并使组织对产生炎症和疼痛的其他介质更为敏感，表明COX2的产生可能会增强对感受器的刺激，产生疼痛感应。本实验大脑匀浆和血清中各组IL-1、IL-6、COX-2 含量与模型组相比均降低，各用药组之间比较差异无统计学意义，提示本方对抗炎、镇痛所产生的效果［17］，并进一步验证了黄芪桂枝五物汤通过调节炎性介质白介素水平，减少COX-2 的释放，以此来减少对伤害感受器的刺激，减缓持续性疼痛的发生。

此外，通过实验发现，神经性细胞因子与疼痛的发生也存在密切的联系。5-HT 是一种可作为神经递质参与疼痛过程的单胺类物质，同时又作为信息载体引发神经疼痛［18］，疼痛处血小板和肥大细胞对5-TH 的释放会对神经末梢产生影响，使得机体产生疼痛感［19］。SP 是一种在机体神经中枢中与疼痛传导息息相关的物质，参与着疼痛传递的过程，SP 将信号由初级神经元传递至次级神经元，影响急性炎症性疼痛的产生和发展［20］，并且在SP 诱导下，5-HT 脱颗粒释放增多。在研究中证明［21］，5-HT 和SP 作为介导疼痛信息传递的重要物质，二者之间互相影响，对痛觉信息传递起到协同作用。DA 作为机体最常见的神经递质之一，在研究中被证明与疼痛有着密切的关系，且在中枢神经系统中，其释放量与持续性疼痛紧密相关［22］。NGF 是一种促进修复神经系统损伤的神经营养因子［23］，是外周感觉神经元生长发育所必需的。近年研究发现，其作用于伤害性神经元及伤害性感受器，并参与炎性疼痛的发生［24］。在研究中表明，在疼痛的过程中总伴随着NGF 的大量异常表达［25-26］。本实验大脑匀浆和血清中各组5-HT、SP、DA 含量与模型组相比均降低，提示黄芪桂枝五物汤抑制各神经性疼痛因子的释放，减少疼痛的产生，SP 释放的减少导致神经元递质传递的减弱，并减少疼痛处血小板和肥大细胞5-TH 释放，使疼痛感降低；与模型组相比，各组NGF 含量均有降低趋势，且随着剂量的增加逐渐降低，但差异无统计学意义，提示黄芪桂枝五物汤对阳虚寒凝型骨关节炎NGF 的产生有一定的抑制作用，但其剂量与疼痛的关系有待进一步研究。

综上所述，黄芪桂枝五物汤对阳虚寒凝型骨关节炎痹症疼痛的止痛作用，与其抗炎、减少神经疼痛因子的产生，及改善机体疼痛状态有关，且其效果与用药剂量有相关性，但其起作用的最佳剂量还需进一步研究。