谷氨酸转运体抑制剂DHK对小鼠焦虑样行为的影响

肖楚丽,肖煦晖,彭丽文,谢一铭,肖志勇

(1.邵阳学院 基础医学院,湖南 邵阳,422000；2.南华大学附属第一医院,湖南 衡阳,421001)

谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性氨基酸,并且参与各种关键性生理和病理过程。谷氨酸稳态的破坏可导致许多神经系统疾病[1-4]。兴奋性氨基酸转运蛋白(excitatory amino acid transporters,EAATs)在谷氨酸的突触再摄取中起关键作用。EAAT家族包括5种亚型,即人类中的EAAT1-5以及啮齿动物中相应的胶质谷氨酸/天冬氨酸转运体(the glial glutamate/aspartate transporter,GLAST)、谷氨酸转运蛋白-1(glutamate transporter-1,GLT-1)、兴奋性氨基酸载体1(excitatory amino acid carrier 1,EAAC1)、兴奋性氨基酸转运体4(excitatory amino acid transporter 4,EAAT4)和兴奋性氨基酸转运体5(excitatory amino acid transporter 5,EAAT5)[5]。 GLAST(EAAT1)和GLT-1(EAAT2)主要在星形胶质细胞中表达,而EAAC1(EAAT3),EAAT4和EAAT5是神经元特异性转运蛋白[6]。其中,GLT-1是主要的谷氨酸转运蛋白,占脑组织中谷氨酸摄取总量的90%以上[5,7]。

诸多证据表明,阻断谷氨酸摄取会导致异常行为。例如,侧脑室内注射或前额叶皮层显微注射GLT-1抑制剂二氢红藻氨酸(dihydrokainic acid,DHK)皮层会诱导快感缺失[8-9]，鞘内或侧脑室内注射非选择性谷氨酸转运蛋白抑制剂L-trans-PDC诱导对排尿反射起抑制作用[10]，GLT1复合物表达水平与记忆训练相关[11]。谷氨酸摄取的阻断影响突触传递和可塑性[12-14]，侧脑室注射DHK损害小鼠新颖物体识别学习能力[15]。然而,GLT1阻断对焦虑样行为的影响仍然很少受到关注。旷场测试是一种检测焦虑样行为的方法,如今已得到广泛应用。本研究基于旷场测试评价侧脑室注射DHK对小鼠焦虑样行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

18只雄性ICR小鼠(30～35 g)购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠配对饲养,自由饮水摄食。饲养环境温度为24 ℃,湿度为50%,明暗周期为7:00至19:00。实验开始前1周,实验者每天抚摸小鼠(3 min/只)。所有行为实验均在白天进行,实验操作遵照美国国立卫生研究院NIH的《国家实验动物健康与管理条例》。实验时随机将小鼠分成溶媒组和DHK组,每组9只,其中对溶媒组进行侧脑室注射PBS(1 μL/只),DHK组侧脑室注射DHK[6.25 μmd/(L·只)],并于给药后30 min以及其后24 h分别进行1次旷场实验。

1.2 侧脑室置管及微量给药

小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(65 mg/kg),待其麻醉后固定于脑立体定位仪上,暴露颅骨并标记前囟点,以前囟点为原点将导管(62202型,瑞沃德生命科学有限公司)向后0.3 mm、向右1.0 mm、向下2.5 mm植入右侧脑室。手术后,小鼠单笼饲养恢复5～7 d。实验结束后,组织解剖发现每组1只导管位置错误,其数据被剔除。

DHK(abcam,cambridge,UK)溶于0.01 M PBS(pH 7.4)侧脑室微量给药。在小鼠清醒状态下用毛巾轻微束缚进行,用微量注射泵通过引导管向侧脑室注射DHK[6.25 nmol/(μl/只)]或PBS缓冲液(1 μl/只),注射速度为0.5 μl/min[15]。

1.3 旷场实验

旷场测试是在1个长宽高为50 cm×50 cm×60 cm的方形黑色聚乙烯的隔音箱中进行。箱子的底部被平均分割成25(5×5)个格子,将中央16(4×4)个格子所组成的区域定义为中央区域[16]。实验时,将小鼠置于箱子中自由探索10 min。通过箱顶摄像头记录小鼠行为并由熟练者双盲统计小鼠直立时间(两只前爪全部离地)、理毛时间、进入中央区域的时间以及小鼠穿越格子数。两组小鼠进行连续2天的旷场测试,每天各10 min。在第1次旷场测试(OFT1)前30 min小鼠侧脑室注射DHK或溶媒,OFT1后24 h进行第2次旷场测试(OFT2),观察2次旷场测试中小鼠理毛时间、进入中央区时间和穿越格子数。

1.4 统计学处理

实验数据采用sigmastat 3.5软件处理,组间比较使用非配对t检验,实验数据用(mean±SE)表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHK注射30 min后对小鼠OFT1焦虑行为的影响

在OFT1阶段,非配对t检验表明,各组小鼠直立样行为时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图1A)。各组小鼠理毛时间比较差异无统计学意义(P>0.05，图1B)。各组小鼠进入中央区时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图1C)。此外,各组小鼠穿越的的格子数比较差异无统计学意义(P>0.05,图1D)。

A-DHK注射30 min后对小鼠OFT1中直立样行为时间的影响；B-DHK注射30 min后对小鼠OFT1中理毛时间的影响；C-DHK注射30 min后对小鼠OFT1中进入中央区时间的影响；D-DHK注射30 min后对小鼠OFT1中穿越的格子数的影响图1 DHK注射30 min后对小鼠OFT1中焦虑样行为的影响(n=8)Fig.1 Effect of DHK injection on anxiety-like behaviors in OFT1 after 30 min(n=8)

2.2 DHK注射24 h后对小鼠OFT2焦虑行为的影响

在OFT2阶段,非配对t检验表明,各组小鼠直立样行为时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图2a)。各组小鼠理毛时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图2b)。各组小鼠进入中央区时间比较差异无统计学意义(P>0.05,图2c)。此外,各组小鼠穿越格子数比较差异无统计学意义(P>0.05,图2d)。

(a)DHK注射24 h后对小鼠OFT1中直立样行为时间的影响；(b)DHK注射24 h后对小鼠OFT1中理毛时间的影响；(c)DHK注射24 h后对小鼠OFT1中进入中央区时间的影响；(d)DHK注射24 h后对小鼠OFT1中穿越的格子数的影响图2 DHK注射24 h后对小鼠OFT2中焦虑样行为的影响(n=8)Fig.2 The effect of DHK injection on anxiety-like behaviors in OFT2 after 24 h(n=8)

3 讨论

既往研究检测了侧脑室分别注射6.25，12.50，25.00 mmol/L 3种剂量的DHK,30 min后对小鼠活动度的影响[15]。结果显示剂量为12.5 mmol/L和25 mmol/L的DHK小鼠活动度明显降低,而剂量为6.25 mmol/L的DHK小鼠的活动度不受影响。鉴于活动度对小鼠焦虑样行为的影响,当前研究选择6.25 mmol/μl的DHK检测其对焦虑样行为的影响。旷场测试是一种广泛应用的检测焦虑样行为的方法。小鼠在旷场中的直立样行为、理毛行为和贴壁行为体现了小鼠的焦虑程度，因此，当前研究统计了小鼠直立样行为时间、理毛行为的时间和进入中央区域的时间来衡量小鼠的焦虑样行为。研究发现6.25 mmol/L的DHK不影响30 min和24 h后旷场测试中小鼠的直立样行为时间、理毛时间、进入中央区时间。此外,实验检测了小鼠穿越的格子数,结果显示DHK不影响30 min后OFT1中小鼠的穿越的格子数以及24 h后OFT2中小鼠穿越的格子数。

有研究表明,在高架十字迷宫模型和恐惧条件化中,DHK中央杏仁核注射(12.5 mmol/L)可导致大鼠焦虑样和抑郁样行为[17]。本研究表明侧脑室注射DHK不影响小鼠焦虑样行为。造成这种差异的原因可能是注射区域的不同。有研究表明，缘下皮层注射DHK(0.5 mmol/L)在大鼠强迫游泳测试中发挥抗抑郁样作用,并且能激活5-TH1A受体[18]。由于抑郁和焦虑的共病性,以及5-TH1A受体激活参与多种抗焦虑作用,提示缘前皮层注射DHK可能具有抗焦虑样作用。本研究侧脑室注射DHK通过脑脊液的循环药物使DHK到达全脑。但因中央杏仁核和缘前皮层2个部位在焦虑行为中的相反作用,从而使侧脑室注射DHK显现出不影响小鼠焦虑样行为的效果。然而,缘前皮层注射DHK对焦虑行为的改善作用仍缺乏直接证据,今后的研究将验证缘前皮层注射DHK的抗焦虑作用。

研究表明,6.25 mmol/L的DHK损害小鼠新颖物体识别记忆获得、巩固和提取[15]。鉴于DHK杏仁核注射诱导小鼠焦虑样行为,因而无法排除是否是DHK诱导焦虑从而损害学习记忆。本研究排除了该剂量DHK对小鼠焦虑样水平的影响，为DHK作为一种新的记忆擦除药物排除其对焦虑情绪的影响提供了证据。然而,1种测试方法难免有局限性,之后的研究将运用高架十字迷宫、黑白箱等检测方式进一步评价DHK对焦虑样行为的影响。

综上所述,DHK注射30 min及24 h均不影响小鼠在OFT中的直立样行为时间、理毛时间、进入中央区时间和穿越的格子数。