超高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中的β-受体激动剂类和喹诺酮类物质

刘新辉，马小岭，季秋红

(1.山东拜尔检测股份有限公司，山东 潍坊261000；2.山东匠造检测有限公司，山东 潍坊，261000)

β-受体激动剂属于苯乙醇胺类药物，是儿茶酚胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的化学类似物，主要有克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、非诺特罗、西布特罗、氯丙那林、西马特罗、马布特罗、马喷特罗、溴布特罗、喷布特罗等。这类药物对心脑血管疾病、糖尿病、冠心病、甲状腺功能亢进、青光眼、前列腺肥大者有不良影响；另外，孕妇中毒可导致癌变、胎儿致畸。我国现行标准GB 31650—2019“整顿办函〔2010〕50号”规定β-受体激动剂属于禁止用于所有食品动物的兽药。喹诺酮是以1,4-二氢-4-氧吡啶-3-羧酸为基本母环结构的化合物，是从萘啶酸或吡酮酸演化而来的合成抗菌药物，主要有洛美沙星、氟甲喹、环丙沙星、达氟沙星、伊诺沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星等。动物性食品中残留较低浓度的药物容易诱导人类致病菌产生耐药性；在较高剂量下，出现站立不稳、烦躁不安、嗜睡等中枢神经系统症状。2015年农业农村部(原农业部)发布的第2292号公告中禁止将洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等4种喹诺酮类抗菌药物用于食品动物。目前测定β-受体激动剂类和喹诺酮类药物的方法有光谱分析、免疫分析[1]、生物传感器技术、毛细管电泳法[2]、气相色谱法[3]、液相色谱法[4]、气相色谱串联质谱法、液相色谱串联质谱法等。现行国家标准β-受体激动剂类的色谱检测方法均需经过酶解，酶解时间需12 h以上[5-6]，且萃取试剂较为复杂，重现性差。本研究采用酸水解法，前处理时间短，成本低，抗干扰能力强，可实现β-受体激动剂类和喹诺酮类药物的准确定性和定量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Cleanert LipoNo购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸铵、甲酸均为色谱纯，购自德国CNW公司；氯化钠为优级纯，购自中国国药集团化学试剂有限公司；克伦特罗(批号50223)、非诺特罗(批号40618AL)、洛美沙星(批号115068)、氟甲喹(批号40110)、环丙沙星(批号41006)、达氟沙星(批号40428)、伊诺沙星(批号30913)、氟罗沙星(批号40505)、诺氟沙星(批号41015)、氧氟沙星(批号21016)、培氟沙星(批号40716)购自德国Dr.Ehrensorfer标准品公司；西布特罗(批号271542)、西马特罗(批号292231)、马布特罗(批号120805)、诺氟沙星-D5(批号291528)、环丙沙星-D8(批号231722)购自德国WITEGA标准品公司；沙丁胺醇(批号170714)、莱克多巴胺(批号170303)、特布他林(批号B0002575)、氯丙那林(批号B0001425)、马喷特罗(批号160414)、溴布特罗(批号160414)、喷布特罗(批号24731)、克伦特罗-D9(批号160414)、莱克多巴胺-D6(批号170427)、沙丁胺醇-D3(批号170222)、氧氟沙星-D3(批号160713)购自北京曼哈格生物科技有限公司；恩诺沙星(批号A1808204)、沙拉沙星(批号A1806133)购自北京坛墨质检科技有限公司；恩诺沙星-D5(批号NY1701036a)购自农业部农产品质量标准研究中心。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290Ⅱ-6460QQQ (配有电喷雾离子源(ESI)及Masshunter Quantitative B.08.00数据处理系统)，美国Agilent公司；AS-E40UVT-R纯水仪，重庆奥思德仪器设备有限公司。

1.3 标准溶液配制

单一标准溶液，称取12种激动剂、11种喹诺酮及7种内标标准物质各10 mg(精确到0.01 mg)用甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制成1.0 g/L的单一标准储备液，在-20 ℃下保存待用；混合标准溶液，从上述单一标准储备液中各吸取1 mL溶液于50 mL容量瓶中，以甲醇将其稀释定容为20 mg/L的混合储备液，吸取混合储备液250 μL于50 mL容量瓶中，以甲醇将其稀释定容为100 Hg/L的混合工作液，于4 ℃下避光保存；按同样方式将7种内标稀释为100 Hg/L的混合内标工作液，于4 ℃下避光保存。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(3.0×100 mm，1.8-Micron)；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸，质量分数)，B为甲醇(含0.1%甲酸，质量分数)；流速0.4 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL；采用梯度洗脱程序：0～2 min，10%B；2～3 min，10%～60%B；3～4 min，60%B；4～5 min，60%～90%B；5～7 min，90%B；7～8 min，90%～10%B；8～10 min，10%B。

1.4.2 质谱条件

三重四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)，干燥气温度为325 ℃，干燥气流速为9 L/min，鞘气温度为350 ℃，鞘气流速为10 L/min，雾化器压力为27.6 Pa。采用多反应监测(MRM)模式进行分析，正离子扫描，具体的质谱条件如表1所示。

表1 23种兽药及7种内标的质谱检测条件
Table 1 The mass spectrometric detection conditions for 23 veterinary drugs and seven internal standard materials

名称离子对m/z碎裂电压/V碰撞能量/eV克伦特罗 277.1/259.1*,277.1/2031005,12莱克多巴胺302/164.1*,302/12111010,22沙丁胺醇 240/222.1*,240/1481005,13西马特罗 220.1/202.1*,220.1/160.11005,13马布特罗 311.1/293*,311.1/2371105,13马喷特罗 325.1/237*,325.1/21711013,13特步他林 226.1/152.1*,226.1/1079010,25非诺特罗 304.1/286.2*,304.1/135.21208,15喷布特罗 292.1/236.2*,292.1/20111012,20西布特罗 234/160*,234/14310010,30溴布特罗 367/212*,367/29312020,15氯丙那林 214.1/196.1*,214.1/15805,13恩诺沙星 360/342.1*,360/316.212020,20诺氟沙星 320/302.1*,320/276.113020,15沙拉沙星 386.1/368.1*,386.1/342.113020,15环丙沙星 332.1/314.1*,332.1/23113520,42氧氟沙星 362/318.1*,362/261.113015,26洛美沙星 352.1/308.1*,352.1/265.113010,20丹诺沙星 358.1/340.1*,358.1/25514025,46培氟沙星 334.1/316.2*,334.1/290.213020,16氟甲喹 262/126*,262/20210050,30依诺沙星 321/303.2*,321/232.112520,36氟罗沙星 370.1/269*,370.1/32613025,15克伦特罗-D9286.1/204.110013莱克多巴胺-D6307.2/167.110013沙丁胺醇-D3243.2/151.210015环丙沙星-D8340.2/322.213518恩诺沙星-D5365.2/261.113026氧氟沙星-D3365.2/321.212018诺氟沙星-D5325.1/307.213017

注：碎片离子中标*为定量离子。

1.4.3 样品前处理

提取：准确称取5.0 g样品(精确至0.01 g)放入50 mL离心管中，加入5 mL 1%乙酸水溶液，加入内标工作溶液100 μL，旋涡混匀10 min。加入10 mL乙腈，于振荡器上剧烈震荡30 min，再加入2 g氯化钠，旋涡混匀2 min，在8 000 r/min条件下离心5 min。

净化：移取5 mL上清液于Cleanert LipoNo净化管中，旋涡混匀2 min，静置分层。移取2 mL上清液在50 ℃下氮气吹干，采用1 mL初始流动相复溶，过0.22 μm滤膜后待测定。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选取

结合以往的研究经验，考察了1%乙酸水-乙腈、1%乙酸乙腈[7]、1%盐酸乙腈、乙腈4种提取溶剂，得到回收率及精密度。结果显示：通过1%乙酸水-乙腈作提取溶剂，样品分散效果最好，先加乙酸水后加乙腈的提取方式，避免了样品因蛋白质变性而发生凝结的现象[8]，故回收率和精密度效果最好。乙腈的回收率和精密度最低，分析原因是缺少酸解，目标物无法从轭合物形态转化为游离态，且乙腈会导致蛋白质变性凝结，部分目标物无法充分释放；采用1%乙酸乙腈和1%盐酸乙腈提取，同样会发生凝结，回收率比乙腈稍高，但低于1%乙酸水-乙腈的提取方式。

2.2 净化方法的确定

比较了Cleanert LipoNo、C18和PSA[9]、乙腈饱和正己烷3种净化方式。Cleanert LipoNo为大颗粒填料，无需离心，操作进一步简化，对甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯均有良好的吸附效果，比其他填料具有更好的去除脂类物质的性能；C18和PSA能吸附油脂和有机酸[10]，但需要经过离心，且复溶液澄清度低，重现性差；因动物源性食品的提取液中含有大量油脂及蛋白，利用乙腈饱和正己烷净化，易发生乳化现象[11-12]，无法进行后续检测。

2.3 色谱和质谱条件的优化

目标物经色谱分离时，流动相、进样介质及体系均会影响色谱峰型[13]，使用甲醇-水作为流动相时，化合物色谱峰会展宽、拖尾、灵敏度降低，在水相中加入乙酸铵和甲酸后可改善目标物的峰型[14]，促进目标物的离子化[15]，因此，选择5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇(含0.1%甲酸)为最佳流动相[16]。23种目标物及7种内标物质检测在10 min内完成，结果显示在既定时间内所有目标化合物均出现峰值，且峰型尖锐对称，进样分析时间短，分离度满足要求[17-18]。

2.4 方法学考察

线性范围与定量限：完成前处理与仪器测定的优化后，可据此配制混合工作液进行后续实验分析，X轴设定为质量浓度，Y轴设定为峰面积，由此完成标准曲线的绘制并进行线性回归。所得结果表明23种兽药的质量浓度范围为0.5～20 Hg/L时，线性关系良好，相关系数R取值范围为0.996 2～0.999 9，具备实验的可行性；同时，以S/N≥10(信噪比≥10)确定方法的定量限质量分数为(0.43～1.02)μg/kg，具体结果如表2所示。

方法的准确度与精密度：选取阴性样品基质，将配制的质量分数为0.5，1.0和2.5 μg/kg的混合标准溶液加入其中，按照确定的提取、净化方法在选定的仪器条件下进行测定，每个浓度水平重复测定6次，计算所得平均回收率为80.2%～106.0%，相对标准偏差RSD为0.52%～9.52%，满足了复杂样品基质中高通量痕量残留检测需求[19]。

表2 23种兽药的相关系数、定量限与回收率
Table 2 Related coefficient,quantitative limit and recovery rate of 10 veterinary drugs

名称RLOQ/(μg/kg)加标量0.5 μg/kg回收率/%RSD/%加标量1.0 μg/kg回收率/%RSD/%加标量2.5 μg/kg回收率/%RSD/%克伦特罗0.998 90.4395.62.0695.33.3391.95.11莱克多巴胺0.996 90.4894.81.2299.62.9897.41.29沙丁胺醇0.997 40.4896.52.0598.77.15102.65.02西马特罗0.998 10.4989.38.0789.60.5295.23.96马布特罗0.996 70.5090.19.0786.92.8789.98.20马喷特罗0.997 50.5080.25.5190.73.8591.63.40特布他林0.998 00.4883.66.0088.71.5988.55.26非诺特罗0.998 60.49105.18.4193.24.9890.63.21喷布特罗0.996 80.5092.94.4584.65.2689.91.09西布特罗0.999 10.4888.56.0290.87.5190.52.22溴布特罗0.998 70.5097.33.4182.95.8294.82.56氯丙那林0.997 60.5096.21.5892.86.4191.73.65恩诺沙星0.997 60.80100.22.2995.62.8596.90.95诺氟沙星0.999 01.0298.63.8594.81.9198.71.23沙拉沙星0.997 31.00109.24.47105.77.6296.96.54环丙沙星0.991 40.80101.36.0994.31.0196.52.25氧氟沙星0.987 10.8590.65.8888.82.0597.63.96洛美沙星0.991 90.9088.27.0684.18.7590.35.62丹诺沙星0.980 51.0085.32.4190.26.9591.82.65培氟沙星0.986 31.0092.76.8591.84.1888.87.41氟甲喹0.969 71.0087.25.4192.63.9693.94.98依诺沙星0.981 71.0091.63.9593.15.8198.63.85氟罗沙星0.986 51.0093.54.82106.03.4090.59.52

2.5 实际样品测定

随机购买10种不同的动物源性食品，根据上述方法对其进行UHPLC-MS/MS测定，检出项目结果如表3所示，鸡肉、鸭肉、鲫鱼、草鱼等4种动物源性食品中均含有恩诺沙星，根据GB 31650—2019的相关规定，恩诺沙星(以恩诺沙星与环丙沙星之和计)在动物肌肉中的限量质量分数为100 μg/kg，而实测结果显示鲫鱼、草鱼中恩诺沙星的残留量分别为132，103 μg/kg，均超出最大残留限量；克伦特罗为禁止检出的药物，依据现有标准定量限在0.5 μg/kg，但检测结果该种兽药在羊肉中的残留量为0.92 μg/kg，也存有超标现象。这说明在水产养殖的过程中应控制相应喹诺酮类药物的使用量；而克伦特罗属于农业农村部明文规定禁止用于所有食品动物的兽药，在养殖过程中应禁止添加β-受体激动剂的药物。标准品、鸡肉样品、羊肉样品的总离子流图(TIC)分别如图1～3所示；西马特罗、特布他林、沙丁胺醇、西布特罗、非诺特罗、氟罗沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、莱克多巴胺、环丙沙星、恩诺沙星、丹诺沙星、洛美沙星、氯丙那林、沙拉沙星、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、马喷特罗、氟甲喹、喷布特罗的色谱图及质谱图如图4所示。

表3 10种样品的UHPLC-MS/MS检出项目的检测结果Table 3 UHPLC-MS/MS test results of 10 samples μg/kg

图1 标准品总离子流图Fig.1 TIC of standard products

图2 鸡肉样品总离子流图Fig.2 TIC of chicken sample

图3 羊肉样品总离子流图Fig.3 TIC of mutton sample

图4 23种兽药的色谱图及质谱图Fig.4 Chromatography and mass spectrograph of 23 veterinary drugs

3 结论

通过优化提取溶剂、净化方法和流动相条件，建立了动物源性食品中的12种β-受体激动剂类和11种喹诺酮类物质的液相色谱-串联质谱检测方法。本方法与国家标准方法比较，操作简便，成本低，抗干扰能力强，重现性高，灵敏度高，选择性强。