姜黄素通过TLR-4/NF-κB信号通路减轻脓毒症相关的急性肠损伤

张永虎 张丹霞 曾良

1南华大学附属第二医院急诊科（湖南衡阳421001）；2衡阳市中心医院消化内科（湖南衡阳421001）

脓毒症（sepsis）是一种主要由感染因素诱发、以炎症系统过度激活为主要病理特征的全身炎症反应综合征，可导致多器官功能衰竭，是重症医学科最常见的疾病［1］。众所周知，胃肠道是多器官功能障碍综合征的始动器官。研究表明［2］，脓毒症可以造成小肠黏膜上皮细胞损伤以及细胞间连接断裂，从而导致肠屏障功能受损、肠道通透性增加。近年来，中医中药治疗脓毒症备受关注，且具有一定的疗效，但大多数都缺乏或未完全阐明其具体作用机制。姜黄素（Curcumin）是从姜科姜黄属植物根茎中提取出的一种天然活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗微生物等多方面的药理作用［3］。有报道称［4］，姜黄素可通过抑制炎症反应改善脂多糖诱导的小鼠脓毒症。也有研究显示，姜黄素对肠道炎症性疾病有一定的改善作用［5］。然而，姜黄素是否可改善脓毒症所致肠损伤，目前鲜有报道。此外，核转录因子-κB（NF-κB）是炎症起始的核心调控因子，不少中药材可通过抑制NF-κB 通路活化达到抗炎效果［6］。因此，本实验拟采用姜黄素预处理脓毒症大鼠，探讨其是否可通过调控TLR-4/NF-κB 通路对脓毒症大鼠所致肠损伤发挥保护作用，旨为临床治疗脓毒症相关急性肠损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体（SPF）级雄性SD 大鼠100只，鼠龄6 ～7周，体质量（260±20）g，由湖北省动物实验中心提供，动物合格证编号：SCXK（鄂）2018-0018。温度为24℃，湿度为50%，12 h 明暗交替，术前禁食12 h，不禁水。

1.2 主要试剂及仪器姜黄素（纯度≥98%）购买于上海阿拉丁公司；苏木素、伊红购于上海碧云天生物公司；中性树脂购于上海长岛生物技术有限公司；一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）ELISA 试剂盒购于美国R&D 公司；Claudin-1、ZO-1、TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65（Ser536）、NF-κB p65 抗体购于美国Cell Signaling Technology 公司；正置显微镜、石蜡切片、摊片机购于徕克显微系统有限公司；石蜡包埋机购于湖北泰维科技实业有限公司；全自动生化分析仪购自Beckman Coulter 公司；全自动数码凝胶图像分析系统购自上海天能科技有限公司；酶标仪购于美国Thermo Fisher Science 公司。

1.3 方法

1.3.1 动物造模及分组处理100 只雄性SD 大鼠，适应性饲养1 周后，随机分成两批，每批分4 组，即假手术组（sham）、模型组（Model）、姜黄素低剂量组（L-Cur，50 mg/kg）、姜黄素高剂量组（HCur，200 mg/kg）。第一批大鼠用于术后24 h 组织及血液样本收集，每组10 只；第二批大鼠用于术后72 h 生存率统计，每组15 只。3%戊巴比妥钠（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，采用盲肠结扎穿孔术（CLP）制备脓毒症大鼠模型［7］，假手术组大鼠只进行相同开腹手术操作，不进行盲肠结扎和穿孔。药物组于造模前24 h 采用十二指肠插管给药方式给予不同浓度姜黄素处理，低剂量组剂量为50 mg/kg，高剂量组剂量为200 mg/kg，假手术组和脓毒症组注射等量生理盐水。

1.3.2 取材及存活率统计第一批大鼠于术后24 h 采用摘眼球取血法取血，4℃下10 000×g 离心10 min，取上清保存备用；随后断颈处死各组大鼠，取小肠组织保存备用。第二批大鼠从术后即刻开始，每隔5 h 统计1 次各组大鼠死亡情况，72 h为终末观察点。

1.3.3 HE 染色观察小肠组织病理变化取小肠组织，洗净后用10%甲醛固定24 h 后脱水处理，常规石蜡包埋，制作3～4 μm 石蜡切片，行苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察病理改变，采用Chui′s 评分［8］评价肠损伤情况。

1.3.4 ELISA 检测血清中炎症因子取各组大鼠血清，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔的OD值，根据标准曲线计算血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量。

1.3.5 小肠组织中NO、MDA含量及SOD活性检测取小肠组织称质量，碾磨至匀浆，4 ℃下10 000×g离心10 min，取上清液。按照试剂盒操作说明书加入相应试剂，孵育后测各样品吸光度值，根据试剂盒操作说明书提供的计算公式分别计算NO、MDA含量及SOD 活性。

1.3.6 Western blot 检测小肠组织中Claudin-1、ZO-1及TLR-4/NF-κB通路相关蛋白表达取各组大鼠小肠组织称质量后加入预冷的组织蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂匀浆，冰上碾磨组织，4℃条件下12 000×g离心20 min，收集上清，采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取25 μg 蛋白进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，并将蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入Claudin-1、ZO-1、TLR-4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65（Ser536）抗体和β-actin 抗体，4 ℃孵育过夜。次日，加入相应二抗室温孵育1 h，ECL 试剂曝光显影，在全自动凝胶成像系统中曝光显影。目的蛋白的相对表达量用目的蛋白与β-actin 灰度值比表示。

1.4 统计学方法所有数据均采用SPSS 22.0 统计学软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；采用Kaplan-Meier 法进行生存分析，采用Log-rank Test 进行生存曲线间比较。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对脓毒症模型大鼠存活率的影响对各组大鼠术后72 h 内存活率进行统计，Kaplan-Meier分析显示，Model 组大鼠中位生存期为45 h，L-Cur组大鼠中位生存期50 h，H-Cur 组大鼠中位生存期为65 h。Log-rank Test 分析显示，H-Cur 组大鼠72 h 生存率显著高于Model 组（P＜0.05），而L-Cur组与Model组比较则差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 各组大鼠术后72 h 生存曲线Fig.1 Survival curve of rats in each group at 72 h after operation

2.2 姜黄素对脓毒症模型大鼠小肠组织病理结构的影响见图2A，sham 组大鼠小肠显示正常肠绒毛结构，排列规则，无充血及断裂现象；Model 组大鼠小肠可见绒毛短细，排列紊乱，黏膜下及基层血管充血明显，表现出淤血及出血，中性粒细胞浸润；L-Cur 组大鼠小肠绒毛短细，排列紊乱，上皮下间隙扩张，伴随黏膜上皮层与固有层的中度分离；H-Cur 组大鼠小肠可见肠绒毛排列尚规则，连续性完整，轻度充血伴上皮轻度抬高，出现轻度的上皮下间隙。见图2B，与sham 组比较，Model 组Chui′s评分显著增加（P＜0.05）；与Model 组比较，L-Cur组Chui′s 评分无显著变化（P＞0.05），H-Cur 组Chui′s 评分显著降低（P＜0.05）。

图2 各组大鼠小肠组织切片病理观察（HE 染色，×200）Fig.2 Pathological changes of small intestine tissue sections（HE staining，×200）

2.3 姜黄素对脓毒症模型大鼠血清中炎症因子水平的影响见图3，与sham 比较，Model 组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著增加（P＜0.05）；与Model 组比较，H-Cur 组血清中炎症因子含量均显著降低（P＜0.05），而L-Cur 组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 姜黄素对脓毒症模型大鼠小肠组织中氧化应激水平的影响见图4，与sham 组比较，Model 组大鼠小肠组织中NO 水平、MDA 含量显著增加（P＜0.05），SOD 活性显著下降（P＜0.05）；与Model 组比较，H-Cur 组大鼠小肠组织中NO 水平、MDA 含量显著降低（P＜0.05），SOD 活性显著增加（P＜0.05），而L-Cur 组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 姜黄素对脓毒症大鼠血清炎症因子含量的影响Fig.3 Effects of Cur on serum inflammatory cytokines in sepsis rats

图4 姜黄素对脓毒症大鼠小肠组织中NO 水平、SOD 活性及MDA 含量的影响Fig.4 Effects of Cur on the NO level，SOD activity and MDA content in intestinal tissues of sepsis rats

2.5 姜黄素对脓毒症模型大鼠小肠组织中紧密连接蛋白Claudin-1 和ZO-1 表达的影响见图5，与sham 组比较，Model 组大鼠小肠组织中Claudin-1和ZO-1 蛋白表达量显著下调（P＜0.05）；与Model组比较，H-Cur 组大鼠小肠组织中Claudin-1、ZO-1蛋白表达量显著上调（P＜0.05），而L-Cur 组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6 姜黄素对脓毒症模型大鼠TLR-4/NF-κB信号通路的影响见图6，与sham 组比较，Model 组大鼠小肠组织中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65（Ser536）水平均显著上升（P＜0.05）；与Model 组比较H-Cur 组大鼠小肠组织中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65（Ser536）水平均显著上升（P＜0.05），而L-Cur 组差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

脓毒症是基于感染因素介导的全身炎症反应综合征（SIRS），在病程中表现为机体和病原体相互作用导致的促炎和抗炎反应失衡，涉及血管内皮细胞损伤、全身炎症反应、免疫功能紊乱、凝血级联反应障碍、氧化应激反应等［9-10］。在国内，运用中医药防治脓毒症及多器官功能障碍综合征（MODS）已成为一个重要的发展方向。本研究发现，高剂量姜黄素干预可显著降低脓毒症大鼠血清炎症反应和小肠组织氧化应激水平，并促进小肠组织中紧密连接蛋白Claudin-1 和ZO-1 表达，抑制TLR-4/NF-κB 信号通路转导，从而提高脓毒症大鼠生存率，改善肠黏膜损伤，表明姜黄素可能通过调控TLR-4/NF-κB 信号通路改善脓毒症模型大鼠急性肠损伤。

图5 姜黄素对脓毒症大鼠小肠组织中Claudin-1 和ZO-1蛋白表达的影响Fig.5 Effects of Cur on the proteins expression of Claudin-1 and ZO-1 in intestinal tissues of sepsis rats

图6 姜黄素对脓毒症大鼠小肠组织中TLR-4、MyD88、NF-κB p65 和p-NF-κB p65（Ser536）蛋白表达的影响Fig.6 Effects of Cur on the proteins expression of TLR-4，MyD88，NF-κB p65 and p-NF-κB p65（Ser536）in intestinal tissues of sepsis rats

CLP 是制备脓毒症动物模型的金标准，其中穿孔处溢出的粪便可造成腹腔感染，同时缺血坏死的结扎段盲肠还可以诱导大量炎症因子的释放，进而形成SIRS［11］。有研究显示［12-13］，采用CLP法制备脓毒症大鼠模型，可于术后12、24 h 即可检测到大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子水平显著增高。本研究结果也显示，术后24 h 模型组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6 和IL-1β含量均显著上升，然而采用高剂量姜黄素干预可显著降低脓毒症大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β等含量，说明姜黄素可降低毒症大鼠血清炎症水平，与SILVA 等［14］研究一致。然而，姜黄素是否可改善脓毒症所致急性肠损伤目前尚未明确。

有研究表明［15］，肠屏障功能障碍是导致脓毒症多器官衰竭的主要原因之一。脓毒症时，大量炎症因子的刺激下iNOS 被诱导表达并在肠道内大量合成NO，同时被激活的中性粒细胞及单核/巨噬细胞将会释放出大量活性氧簇，造成肠黏膜氧化损伤，引起肠道屏障功能障碍和肠通透性增加，从而导致肠道内细菌、细菌产物以及其他腔内内容物的移位，直接或间接导致远处组织损伤或炎症［16］。而姜黄素具有天然的强抗氧化能力，不仅能够抑制氧自由基的生产，还能够清除氧自由基以及抑制脂质过氧化［17］。本研究结果显示，模型组大鼠小肠组织损伤严重，且NO 水平和MDA含量显著增加，而SOD 活性显著降低，说明脓毒症模型大鼠小肠组织确实存在较高水平的氧化损伤。然而，高剂量姜黄素干预可改善脓毒症大鼠小肠组织损伤，并降低小肠组织NO 水平和MDA含量，提高SOD 活性。说明姜黄素可降低脓毒症大鼠小肠组织氧化损伤。OUYANG 等［18］研究也显示，姜黄素可通过抑制炎症反应和氧化应激损伤改善肠黏膜损伤。此外，正常肠道屏障主要由肠上皮细胞间连接形成的机械屏障和肠道内菌群平衡组成的生物免疫屏障等共同构成，能够有效阻止肠道内菌群及内毒素等有害物透过肠黏膜进入血液。肠道上皮细胞间紧密连接主要是由跨膜蛋白Claudin 和紧密连接蛋白ZO-1 组成的复合体，位于细胞间连接的最顶端，组成了肠上皮下基质与肠腔间的第一道机械屏障［19］。大量研究显示［10，20］，发生肠屏障功能障碍时，Claudin 和ZO-1 蛋白表达水平显著降低。本研究结果显示，模型组大鼠小肠组织中Claudin 和ZO-1 蛋白表达量下降，而高剂量姜黄素干预后可显著上调小肠组织中Claudin和ZO-1 的表达。表明，姜黄素可改善脓毒症大鼠肠屏障功能障碍。

TLR4/NF-kB 通路是调控炎症反应的重要信号通路，在炎症反应中TLR4 触发细胞内信号传导通路，经髓样分化因子88（MyD88）激活NF-κB 转入细胞核，从而诱导TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达［21］。ZHAN 等［22］研究显示，在脓毒症诱导的肠屏障功能障碍大鼠肠组织中NF-κB 通路被显著激活。而多项研究［23-24］表明，姜黄素可以阻断TLR4/NF-kB 通路的转导。然而，姜黄素是否通过该通路发挥改善脓毒症相关急性肠损伤还未知。本研究中结果显示，模型组大鼠小肠组织中TLR4、MyD88 蛋白以及磷酸化NF-κB 水平均显著增加，表明，脓毒症大鼠小肠组织TLR4/NF-kB 通路被显著激活。而采用高剂量姜黄素干预后脓毒症大鼠小肠组织中TLR4、MyD88 蛋白以及磷酸化NF-κB 水平均显著下降，说明姜黄素可能是通过阻断TLR4/NF-kB 信号通路，从而发挥减少脓毒症相关的急性肠损伤作用。

综上所述，姜黄素可以通过抑制TLR-4/NF-κB信号通路转导，降低脓毒症大鼠血清炎症反应以及小肠组织氧化损伤，从而改善大鼠脓毒症相关的急性肠损伤。本研究确定了姜黄素减轻脓毒症相关的急性肠损伤的作用通路，但是具体的作用靶点未予涉及，需要后续的进一步研究。