左旋肉碱和茶多酚对脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用及机制比较

许明贤 张洁容 唐瑞娣 喻玺 谢彦 邹昌业

1中山大学附属第一医院骨科（广州510080）；2广州医科大学（广州510210）

我国是肝病大国，以感染性肝病最为多见。急性肝损伤常由感染、中毒、代谢异常、缺血缺氧等众多原因导致。严重影响肝脏的解毒、合成、生物转化和排泄等功能甚至失代偿发展为肝功能衰竭。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌产生的内毒素，诱导氧化应激和全身炎症反应可引起肝脏损伤［4-5］，常用于急性肝损伤模型的制备［6-7］。LPS 不但可以加重肝硬化和酒精肝病肝损伤，而且明显增强乙醇等肝脏毒物的肝毒性［8-9］。茶多酚（tea polyphenol，TP）是从天然植物茶叶中分离提纯出来的多酚类化合物的复合体，作为一种常见抗氧化食品添加剂而被广泛应用于食品加工行业。茶多酚具有抗细胞凋亡并且对缺血再灌注肝损伤、四氯化碳导致的肝损伤和肝纤维化有保护作用［10-11］。肉碱在哺乳动物体内只有左旋体由赖氨酸转化生成的。左旋肉碱也常作为添加剂应用于食品领域、医药、保健等。研究发现，左旋肉碱（L-carnitine，LC）具有促进脂肪酸氧化，调节机体脂质代谢，抗炎抗氧化的功能［12-15］。但是目前现有研究中，对比较左旋肉碱和茶多酚两种药物对LPS 诱导的小鼠急性肝损伤的氧化应激和抗炎反应研究尚缺。本实验通过比较分析茶多酚与左旋肉碱在LPS 诱导的小鼠急性肝损伤中是否有保护效果及两药物效果，是否可通过抗炎和抗氧化应激两方面机制来缓解肝损伤，为临床诊疗提供新的药物借鉴。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物药品及试剂SPF 级KM 雄性小鼠［体质量（35±3）g，购于中山大学动物中心］。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒，超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）测试盒、ALT 测试盒、AST测试盒均购于南京建成生物工程研究所。小鼠TNF-α和IL-1β ELISA 试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。脂多糖（sigma）购于合肥博美生物科技有限责任公司。茶多酚（纯度98.06%）购于浙江杭州同发生物科技有限公司。左旋肉碱（纯度98%）购于浙江诚达药业股份有限公司。

1.2 实验设计40 只雄性SPF 级KM 小鼠随机分为4 组（n= 10）：假手术组（sham 组）、模型组（LPS组）、左旋肉碱治疗组（LC+LPS 组）和茶多酚治疗组（TP+LPS 组）。腹腔注射LPS（10 mg/kg）方法复制小鼠急性肝损伤模型，sham 组注射同样剂量生理盐水［1］。治疗组于术前7 d 开始，持续8 d 分别用左旋肉碱溶液灌胃（500 mg/Kg，qd）［2］和茶多酚溶液灌胃（200 mg/Kg，qd）［3］。造模24 h 后眼球取血，分离血清测定ALT、AST、MDA、SOD、GSH 含量。取出肝脏称重计算肝脏系数（肝脏质量/小鼠质量×100%），计算称量后取部分肝脏制备肝脏匀浆并检测匀浆中炎症因子TNF-α、IL-1β含量，另取部分肝脏组织做HE 染色切片对比显微镜镜下（10×40）肝组织损伤情况。

1.3 统计学方法用Excel 对实验数据进行统计整理，然后采用SPSS 17.0 对所得各组数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），方差具有齐性则进一步用LSD-t法进行两两比较，方差不齐者则用Dunnett T3 法进行两两比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 左旋肉碱和茶多酚显著降低LPS 小鼠血清中ALT、AST 含量，左旋肉碱效果更佳与假手术组（sham组）相比，LPS引起小鼠血清ALT、AST含量显著增加，表明LPS 诱导肝功能损伤模型成功建立（P＜0.05）。左旋肉碱和茶多酚均能明显降低丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）含量（P＜0.05）。与茶多酚治疗组相比，左旋肉碱在降低ALT、AST 含量上效果更好（P＜0.05），对缓解肝肝损伤效果更好。见图1。

图1 茶多酚与左旋肉碱改善LPS 引起的肝功能指标改变Fig.1 L-carnitine and Tea polyphenol improve the liver function index changes induced by LPS

2.2 左旋肉碱和茶多酚明显改善LPS 引起的肝细胞损伤，并降低肝系数小鼠肝组织苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）显微镜（400×）下观察肝细胞形态。假手术组（sham 组）肝组织结构正常，排列整齐，肝细胞形态正常；模型组（LPS 组）肝组织明显肿胀，排列紊乱，肝窦扩张充血，肝细胞间隙可见炎细胞浸润并出现出血坏死。左旋肉碱治疗组、茶多酚治疗组肝组织病理损伤明显减轻；左旋肉碱治疗组与茶多酚治疗组比较，两组切片镜下观察肝损伤程度没有显著区别。与假手术组（sham 组）相比，模型组（LPS 组）小鼠肝系数明显增加（P＜0.05）；与LPS 组相比，左旋肉碱和茶多酚明显降低肝系数（P＜0.05），但左旋肉碱和茶多酚对肝系数的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、3。

图2 肝脏HE 染色病理切片（400×）Fig.2 Pathological sections of liver stained with HE（400×）

图3 左旋肉碱和茶多酚对小鼠肝脏系数的影响Fig.3 The effect of L-carnitine and Tea polyphenols on liver index in mice

2.3 左旋肉碱和茶多酚明显改善LPS 引起的氧化应激反应与假手术组（sham 组）相比，模型组（LPS 组）小鼠血清SOD、GSH 含量显著降低，MDA含量显著增加（P＜0.05）；与LPS 组相比，左旋肉碱治疗组、茶多酚治疗组血清SOD、GSH 含量显著增加，MDA 含量降低（P＜0.05）；与左旋肉碱治疗组相比，茶多酚治疗组小鼠血清GSH、SOD 含量显著升高，血清MDA 含量显著降低（P＜0.05）。见图4。

2.4 左旋肉碱和茶多酚改善LPS引起的炎症反应与假手术组（sham 组）相比，模型组（LPS 组）肝脏组织中TNF-α、IL-1β含量显著升高（P＜0.05）；与模型组（LPS 组）相比，左旋肉碱治疗组和茶多酚治疗组TNF-α、IL-1β含量显著降低（P＜0.05）；左旋肉碱治疗组肝脏组织中TNF-α、IL-1β含量较茶多酚治疗组显著降低（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

图4 左旋肉碱和茶多酚改善LPS 引起的氧化应激指标Fig.4 L-carnitine and tea polyphenols improve the indexes of oxidative stress induced by LPS

图5 左旋肉碱和茶多酚改善LPS 引起的炎症反应Fig.5 L-carnitine and tea polyphenols improve the inflammatory response induced by LPS

LPS 诱导的急性肝损伤在临床上较常见。笔者之前的实验研究发现，LPS 可以诱导小鼠产生氧化应激与炎症反应从而导致肝损伤［1］。LPS 与机体炎症效应细胞表面受体识别病原体表面的抗原，进而激活细胞内MAPKs-NF-κB 信号通路，诱导炎性介质及多种促炎因子的生成和释放，引发级联扩大机体炎症反应［16］。炎症反应阻碍肝脏微循环，引起肝脏缺血、缺氧和氧化应激等反应，导致肝损伤［17］。血清中ALT 和AST 含量都是临床常用来衡量肝损伤的重要指标，ALT 与AST 的活力表现了肝脏病理生理情况［18-19］。本实验中LPS 组中肝组织HE 染色病理切片显示肝组织明显肿胀，排列紊乱，肝窦扩张充血，肝细胞间隙模糊可见炎细胞浸润并出现出血坏死，肝脏系数显著增加（P＜0.05），小鼠血清中ALT、AST 含量显著升高（P＜0.05），实验结果表明腹腔注射LPS 诱导小鼠急性肝损伤显著。与茶多酚组相比，左旋肉碱组降低血清中ALT、AST 含量更为显著（P＜0.05），说明左旋肉碱对LPS 诱导的急性肝损伤缓解效果更优越。

MDA、SOD、GSH 均是衡量机体抗氧化的重要指标。MDA 是体内脂质被自由基攻击所产生的脂质过氧化物，可间接反映氧自由基含量的变化；SOD 是机体重要的超氧自由基清除因子，它通过使氧自由基发生歧化反应，其活力的高低反映了抗氧化和防御自由基损伤的能力；GSH 是机体内最重要的非酶性抗氧化剂和自由基清除剂［20-21］。本研究结果显示：与假手术组比较，小鼠腹腔注射LPS 导致血清中MDA 含量显著增加（P＜0.05），SOD 和GSH 含量显著降低（P＜0.05），表明小鼠腹腔注射LPS 可导致小鼠机体产生明显氧化应激反应与上述研究结果一致。与模型组相比，左旋肉碱治疗组和茶多酚治疗组的血清中MDA 含量明显降低，SOD、GSH 含量明显升高，表明左旋肉碱和茶多酚均可提高小鼠机体的抗氧化应激能力，通过抵抗LPS 导致的氧化应激反应从而缓解小鼠急性肝损伤。与左旋肉碱治疗组相比，茶多酚治疗组血清中SOD、GSH 含量显著升高，说明茶多酚对LPS 诱导的急性肝损伤中抗氧化作用更强（P＜0.05）。茶多酚作为一种天然抗氧化剂，除了可以直接清除活性氧自由基和抑制脂质过氧化外，还可以螯合铁离子，影响氧化过程的进行以及激活细胞内抗氧化防御系统［22］。左旋肉碱诱导了线粒体ROS 生成减少具有抗氧化应激功能［15］。BODAGHI-NAMILEH 等［23］的研究表明，左旋肉碱可以降低体内MDA 含量，提高SOD 含量，与本研究结果一致。本研究结果提示两种药物均具有抵抗LPS 诱导的氧化应激反应能力，均可抑制自由基产生，有利于临床应用抗氧化药物提供新的借鉴思路。但其具体机制通路和涉及抗氧化应激相关基因有待进一步研究。

LPS 会导致体内TNF-α，IL-1β等炎症因子的释放，炎症因子IL-1β会激活JAK-STAT 信号通路的磷酸化，继而损害肝脏［24-25］。TNF-α是通过NF-κB 信号通路而导致肝损伤［26］。在本实验中，与假手术组比，模型组肝脏组织中TNF-α，IL-1β显著增加（P＜0.05），结果表明小鼠腹腔注射LPS 诱导机体产生炎症介质造成急性肝损伤。与模型组相比，左旋肉碱治疗组、茶多酚治疗组肝脏组织中IL-1β和TNF-α含量均明显降低，表明左旋肉碱和茶多酚均具有抗炎作用，但左旋肉碱降低炎症指标的效果明显优于茶多酚（P＜0.05）。冯亮等［3］的研究表明，茶多酚可以降低酒精性肝损伤细胞内ALT、AST、MDA、TNF-α和IL-1β含量，同时还可以升高血清中SOD、GSH 的含量，与本实验研究结果一致。实验结果提示两种药物都能通过抑制炎症因子IL-1β和TNF-α的产生，缓解LPS 诱导的小鼠急性肝损伤，但是该两种药物是否对其他炎症介质也有抑制生成作用有待进一步研究。

综上所述，茶多酚、左旋肉碱均可缓解脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤，左旋肉碱缓解肝损伤效果更佳。其作用机制与增强机体抗氧化应激和抗炎能力有关，本实验数据表明左旋肉碱主要通过提高抗炎能力缓解肝损伤，在抗氧化应激方面茶多酚效果更为优越，两种药物对缓解LPS 诱导小鼠急性肝损伤具体机制及疗效机制比较有待进一步研究。