染色体核型分析联合快速MLPA非整倍体技术在产前诊断中的应用

邓国生

(广西壮族自治区玉林市妇幼保健院 检验科，广西 玉林537000)

染色体核型分析技术是检查人类染色体金标准方法，但染色体核型分析技术要细胞培养，检测时间长，操作程序复杂，技术要求高，2002年荷兰White和Schouten创建了多重链接依赖性探针扩增技术(MLPA)[1-3]，MLPA不用细胞培养，是一种快速简单的检测方法。为了探讨染色体核型分析联合MLPA非整倍体技术在产前诊断中的应用价值，对2000例有产前诊断指征孕妇羊水，分别采用染色体核型分析和MLPA非整倍体技术检查，结果总结如下。

1 资料与方法

1.1 资料

2018年1月至2018年6月，在玉林市妇幼保健院优生遗传科就诊的2000例有产前诊断指征孕妇，同意行羊膜腔穿刺抽取羊水，并签署知情同意书。其孕周在18-24周，年龄在(16-45)岁之间。进行染色体检查及MLPA非整倍体检测。

1.2 仪器与试剂

仪器：黑马TGL-16H台式高速离心机，K30B干式恒温器，PCR梯度扩增仪，ABI 3500基因分析仪，美国Formar CO2培养箱，洁净工作台。试剂：DNA提取液，荷兰MLPA试剂盒(P095)，广州白云山羊水培养基、美国张氏培养基。

1.3 羊水细胞培养、制备及染色体核型分析

在羊水穿刺前均告知孕妇及其家属进行羊水染色体分析的产前诊断范围与风险，并签署知情同意书。在无菌条件下，经B超引导定位下行羊膜腔穿刺术，抽取羊水26 ml，分别置于3支15 ml无菌离心管中，其中1支6 ml羊水送至分子遗传实验室做MLPA P095检测。1 500转/分离心10 min，在超净工作台无菌操作，去上清液后分别加入5ml两种不同厂家培养基，用无菌吸管吹打混匀，并分别放入两个不同厂家培养瓶于两个独立的37℃5%CO2培养箱培养7-8天，在倒置显微镜下观察贴壁细胞克隆大小并进行换液，继续培养1-2天后观察发现有6-8个集落均为圆形透亮的细胞时加入秋水仙素阻断，收获、制片和G显带，并进行核型分析。根据人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2013)标准进行描述染色体核型，并出具染色体核型分析报告。

1.4 MLPA方法

按羊水的DNA提取、PCR扩增、毛细管电泳及结果分析等步骤进行[4]。

2 结果

2.1 羊水细胞染色体核型分析

羊水染色体培养2000例，培养成功率100%，其中检测出异常染色体62例，检出率31.00‰，异常染色体中数量最多前6位为47,Xn,+21核型18例;47,Xn,+18核型6例;46,X,inv(Y)(p11q11)核型4例;45,Xn,der(13;14)(q10;q10)核型2例;47,XYY核型2例;46,Xn,del(22)(p11.2)核型2例。结构异常22例，嵌合体12例。见表1。

2.2 多重链接依赖性探针扩增技术非整倍体检查

羊水MLPA检测2000例，检测成功率100%，检测出异常染色体31例，阳性率15.50‰，其中47,Xn,+21核型18例;47,Xn,+18核型7例;47,Xn,+13核型1例;47,XXY核型 1例;47,XYY核型 2例;45,X嵌合体1例;47,XXY嵌合体1例。见表2。

3 讨论

本研究表明，可以看出MLPA检测21、18、13、X、Y染色体非整倍体时，结果与核型分析100%符合，易倍型18三体与核型分析100%符合，45,X嵌合体、47,XXY嵌合体也与核型分析100%相符合。MLPA对于染色体平衡易位、一些非平衡易位、倒位等检测不出。染色体核型分析检测有产前诊断指征孕妇异常染色体核型检出率31.00‰远远高于MLPA检测检出率15.50‰。MLPA检测尽管能快速检测也不能完全替代金标准染色体核型分析技术检测，二者结合检测可以免去染色体核型分析技术检测不成功之扰，MLPA检测结果也经染色体核型分析技术检测验证，提高染色体检测准确率，对提高人口出生质量有重要意义。

表1 羊水染色体核型异常结果

染色体核型分析检测结果准确可靠，可检测人类染色体倍数改变，也可以检测染色体缺失、重组等结构改变，是染色体产前诊断一项金标准检测方法[5,6]，但染色体核型分析技术要细胞培养，检测时间长，操作程序复杂，技术要求高，往往有检测不成功案例。根据作者李金鸽等[7]报道，对西安地区72例流产绒毛组织染色体核型分析，培养未成功20例，培养未成功率为27.78%。根据作者黄和明等[8]报道，对286稽留流产患者绒毛组织的染色体核型分析，培养未成功24例，培养未成功率为8.39%。根据作者胡道琴等[9]报道，对116例稽留流产患者绒毛细胞染色体核型分析，培养未成功5例，培养未成功率为4.31%。根据作者雷冬竹等[10]报道，对湖南郴州地区106例自然流产绒毛细胞染色体核型分析，培养未成功4例，培养未成功率为3.77%。根据作者李艳华等[11]报道，对有产前诊断指征孕妇羊水650例进行染色体核型分析检测,培养未成功16例，培养未成功率为2.17%。根据作者蔡美英等[12]报道，对960份胎儿脐带血进行染色体核型分析检测,有10份脐带血培养未成功,未成功率为1.04%。

MLPA技术是一种针对靶核酸序列进行定性和定量分析技术，从DNA提取至检测结果时间仅要1至2个工作日，一个反应可对多达50个基因目标位点的重复、缺失、单核苷酸多态性等进行检测[13，14]，其原理为基因捕获+PCR+毛细管电泳分离，设备自动化程度高，设有质控探针，可检测实验过程中出现问题，确保实验结果准确性，同时可检测几十个样本，具有快速、高通量的优势。

MLPA技术无法对染色体的结构异常以及部分嵌合体、缺失、三倍体少见染色体的数目的变化检测[15]，本研究采用MLPA技术检测，检测出异常染色体31例，而采用染色体核型分析检测，检测出异常染色体达62例，用MLPA技术少检测50%异常染色体，故不能单独用一种方法检测。MLPA技术检测，检测标本细胞至少需要3000个，不能用于单细胞检测，MLPA技术无法检测染色体平衡易位，MLPA带有的端粒特异性检测探针可以检测绝大部分的染色体不平衡易位[16]，当有母体细胞污染可能会导致结果判断错误。因此，快速MLPA检测联合染色体核型分析实现优势互补,提高产前胎儿染色体异常检出率和准确率，为产妇提供准确的胎儿染色体信息，提高优生指导服务，提高人口出生质量，具有良好的临床应用价值。