PGT-A患者囊胚整倍体率的临床影响因素分析*

刘 美,胡玥玥,3,刁红录,3,4,5,张昌军,3,5*

[1.十堰市人民医院(湖北医药学院附属人民医院)生殖医学中心，十堰 442000;2.湖北省生殖医学临床医学研究中心，十堰 442000;3.湖北医药学院生物医学工程学院，十堰 442000;4.湖北医药学院生物医药研究院，十堰 442000;5.胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，十堰 442000]

随着二胎政策的开放，越来越多的高龄女性加入生育大军，但这部分患者的妊娠率较年轻患者明显降低，胚胎整倍体性是非常重要的因素。植入前胚胎非整倍体遗传学筛查(preimplantation genetic testing for aneuploidy,PGT-A)技术可将整倍体胚胎筛选出来，从而提高高龄女性的妊娠率。关于胚胎整倍体的研究很多，其影响因素多为女性年龄，其他因素提及甚少。本文从临床的角度，探讨囊胚整倍体率的临床影响因素，以期为临床提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾研究2018年4月至2020年12月在湖北省十堰市人民医院生殖中心行PGT-A助孕的患者。纳入标准(以下标准满足任何一项即可)：(1)女方高龄(女方年龄38岁及以上)；(2)不明原因反复自然流产(自然流产2次及以上)；(3)不明原因反复种植失败(移植3次及以上或移植高评分卵裂期胚胎数4～6个或高评分囊胚数3个及以上均失败)；(4)严重畸形精子症。纳入人群中夫妇染色体核型均为正常，不明原因的反复种植失败不要求连续性。排除标准：(1)进入试管婴儿周期后因各种原因未能取卵或受精；(2)取卵后因各种原因要求取消活检；(3)无可活检囊胚者；(4)活检后拒绝检测；(5)数据不完整；(6)夫妻双方之一染色体异常。最终共纳入166个周期(150例患者)，年龄25～47岁，患者均行遗传咨询并签署PGT-A相关同意书。

1.2 促排卵及受精

1.2.1 超促排卵 PGT患者主要采用2种促排卵方案：黄体期长方案和高孕激素状态下促排卵(PPOS)方案。黄体期长方案：黄体中期开始给予曲普瑞林(达必佳或达菲林)0.1mg/d，皮下注射，连用14～20d，给予促性腺激素150～300IU/d，皮下注射，待主导卵泡直径达到18～20mm，给予艾泽250μg及绒促性素(HCG)2000IU板机。高孕激素状态下促排卵(PPOS)方案：月经第2～3d开始给予促性腺激素100～225IU/d，皮下注射及安宫黄体酮8～10mg/d，口服，待主导卵泡直径达到20～22mm，给予达必佳0.1mg及HCG 2000IU板机。

1.2.2 囊胚活检及检测 扳机后36～39h行经阴道穿刺取卵术，取卵后采用卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)受精，并将胚胎培养至受精后5～6d，即囊胚期，从4BB及以上囊胚取出4～7个滋养外胚层细胞进行胚胎活检，将活检后的囊胚进行玻璃化冷冻。将活检的滋养外胚层细胞进行单细胞扩增，并进行扩增产物文库构建，遗传学分析方法采用嘉宝仁和公司illumina二代测序平台检测胚胎染色体的整倍性。整倍体囊胚的定义：检测报告单提示为46，XN。非整倍体囊胚的定义：检测报告单提示除外46，XN以外的所有囊胚，包括：嵌合体、染色体片段的缺失、重复。我中心PGT-A可检测>4Mb片段性重复或缺失和>30%比例嵌合体。

1.2.3 血清维生素B12、空腹血糖及血清TSH水平检测 进入试管婴儿周期前3个月内检测维生素B12、空腹血糖及血清TSH水平。血清TSH水平、血清维生素B12水平检测均使用贝克曼的UniCel DxI 800，采用化学发光法。空腹血糖为空腹8～10h的清晨静脉血。

1.3 观测指标 囊胚整倍体率的临床影响因素，囊胚的整倍体率=检测的整倍体囊胚/所有检测的囊胚。

1.4 研究方法 将患者按囊胚整倍体率分为两组：囊胚整倍体率≤50%者103例，囊胚整倍体率>50%者63例。比较两组间有显著差异的变量，将筛选出有显著差异的变量做多因素分析。将年龄(低龄组：≤35岁；高龄组：>35岁)和维生素B12(维生素B12低水平组：≤497.39pmol/L；维生素B12高水平组：>497.39pmol/L)分层，进一步研究这两者对囊胚整倍体率的影响。

2 结 果

2.1 基本临床资料 共纳入166个周期(150例患者)，共获卵1413枚，其中MⅡ卵1244枚，共计活检囊胚469个，其中整倍体囊胚243个(51.81%，243/469)，非整倍体囊胚226个(48.18%，226/469)。两组的男方年龄、女方年龄、血清维生素B12水平、获卵数、促排卵方案比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者各临床因素的比较

2.2 囊胚整倍体率二元logistics回归结果 将男方年龄、女方年龄、血清维生素B12水平、获卵数、促排卵方案为自变量，囊胚整倍体率为因变量,行二元logistics回归分析。结果显示，女方年龄和血清维生素B12水平是囊胚整倍体率的独立影响因素(OR=0.840，95%CI为0.738～0.957，P<0.01；OR=1.001，95%CI为1.000～1.002，P=0.045)。选择年龄和血清维生素B12水平对囊胚整倍体率高于50%进行预测，预测准确性为68.1%。见表2。

表2 囊胚整倍体率二元logistics回归结果

2.3 低龄组和高龄组中不同水平维生素B12对囊胚整倍体率的影响 低龄组中，维生素B12低水平组和维生素B12高水平组的整倍体率比较，差异无统计学意义(58.00% vs 63.16%，P=0.347)。在高龄组中，维生素B12低水平组和维生素B12高水平组的整倍体率比较，差异有统计学意义(24.36% vs 41.38%，P=0.035)。见表3、4。

表3 低龄组(≤35岁)不同水平维生素B12的组间比较

表4 高龄组(>35岁)不同水平维生素B12的组间比较

3 讨 论

胚胎质量是影响试管婴儿成功率的重要因素，非整倍体形成主要是由卵母细胞第一次减数分裂(MI)中同源染色体(二价体)的错误分离引起的[1]。研究表明，PGT-A可明显改善高龄(大于35岁)及反复妊娠丢失患者的妊娠结局[2-3]，而胚胎活检并不会增加子痫前期、妊娠相关高血压、胎盘疾病、早产或低出生体重及妊娠期糖尿病的发病风险[4]。在一次取卵中获得更高比例的整倍体胚胎至关重要，女方年龄是已知的因素，其与胚胎的非整倍体呈正相关[5-6]，但其他因素能否影响胚胎的整倍体率尚不明确。

3.1 AMH与胚胎整倍体率 AMH与胚胎整倍体率的相关性尚存争议。既往研究表明，卵巢储备功能减退与胚胎或胎儿非整倍体增高有关[7-8]。研究认为，在37岁以下不孕女性中，血清AMH和整倍体胚胎的比率呈显著正相关，而在37岁以上女性中两者则无显著相关性[9]。Jiang等[10]认为,女性年龄大于35岁时，胚胎非整倍体率在不同的AMH分组中有显著差异，但在小于35岁患者中无明显相关[10]。本研究发现，AMH并非胚胎整倍体率的独立影响因素。本研究中年龄中位数为33岁，结论与Jiang等相似。

3.2 Gn量与胚胎整倍体率 李为玉及张晋宁等[11-12]均认为，外源性Gn用量对胚胎非整倍体率均无明显影响。本研究认为，Gn量与胚胎整倍体率无关，与上述研究结论相似。

3.3 空腹血糖与胚胎整倍体率 关于空腹血糖对胚胎整倍体率影响的报道甚少。研究发现，2型糖尿病的ART患者，如血糖控制良好或尚可，结局同血糖正常组，而血糖控制不佳则影响卵子和胚胎质量[13]。有针对小鼠的研究发现，胚胎培养液中葡萄糖浓度越高，内细胞团和滋养外胚胎层细胞减少越明显[14]。另有研究发现，糖尿病小鼠卵泡中颗粒细胞凋亡明显增加[15]，推断血糖增高可能影响卵子质量和胚胎质量。本研究并未发现，胚胎整倍体率和空腹血糖有关。可能是因本研究中患者的空腹血糖在正常范围内或轻微升高。对于空腹血糖明显异常的患者，空腹血糖水平和胚胎整倍体率是否有关,需进一步研究。

3.4 血清TSH与胚胎整倍体率 关于TSH是否影响胚胎整倍体的报道甚少。有研究发现，TSH并不是胚胎染色体异常的独立危险因素[16]。研究发现，基础TSH水平与MII卵率、受精率、2PN率、2PN卵裂率、种植率无关[17]。本研究并未发现胚胎整倍体率与基础TSH有关。但本研究中所有甲状腺功能异常者在取卵前均接受了治疗，如不治疗，异常的TSH是否增加胚胎整倍体率不明确，有待进一步研究。

3.5 血清维生素B12与胚胎整倍体率 大量研究提示，维生素B12缺乏可能导致胚胎停育[18-19]。对于血清维生素B12对胚胎整倍体的影响，文献报道极少，大部分是对于卵子质量和胚胎质量的报道。1981年Scott等报道，细胞内维生素B12水平下降，MTR/MTRR活性降低，一碳代谢受阻[20]。有研究对哺乳动物的卵母细胞在体外进行培养发现，培养体系在一碳缺乏的条件下，窦卵泡发育和卵母细胞成熟均受到损害，如补充维生素B12可改善胚胎质量[21-22]。有研究发现，在辅助生殖技术中，维生素B12缺乏可导致卵泡液同型半胱氨酸浓度升高，与卵母细胞和胚胎质量受损相关，从而降低辅助生殖技术的成功率[23-25]。还有研究报道，低水平维生素B12和胚胎发育延迟相关[26]。上述研究均提示维生素B12缺乏导致卵泡和胚胎发育延迟或胚胎质量受损。本研究和上述研究结果类似，血清维生素B12水平是囊胚整倍体率的独立影响因素，对年龄进行分层后发现，在年龄及其他条件相似的情况下，维生素B12低水平组的整倍体率低于维生素B12高水平组，在低龄组两者的差异无统计学意义，但在高龄组两者差异有统计学意义。其可能机制：维生素B12为甲硫氨酸合成酶的辅酶，维生素B12缺乏时可导致甲硫氨酸合成酶活性降低。同型半胱氨酸甲基化转变为甲硫氨酸的过程受阻，导致甲硫氨酸及S-腺苷甲硫氨酸(SAM)含量降低，而同型半胱氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)堆积，SAM/SAH比例下降，导致DNA转甲基酶活性受到抑制，出现DNA低甲基化，会增加染色体不分离的风险[27]。此外，SAM生成受阻会影响DNA、RNA合成、修复造成细胞分化、发育异常和凋亡,导致DNA甲基化的紊乱，造成基因表达抑制、染色体的失活等[28]。相比于年轻女性，高龄女性维生素B12水平对囊胚整倍体率的影响原因不明，可能原因为，与年轻女性相比，高龄女性同型半胱氨酸水平本身会生理性升高，如维生素B12摄入不足，会导致同型半胱氨酸水平进一步升高，而同型半胱氨酸水平升高与卵母细胞和胚胎质量受损相关[24]。已有研究表明，孕妇MTHFR C677T基因突变导致的高同型半胱氨酸血症与胎儿染色体非整倍体相关[29]，异常升高的同型半胱氨酸水平导致囊胚整倍体率更低。

综上所述，女方年龄和血清维生素B12水平均为囊胚整倍体率的独立影响因素。相比于年轻女性，高龄女性维生素B12水平对PGT-A技术助孕患者囊胚整倍体率的影响更大。血清维生素B12水平在何种范围能达到更高的囊胚整倍体率，值得进一步研究。