奥美沙坦酯对阿霉素肾病大鼠klotho蛋白表达及氧化应激的影响

高 华，张 静，周忠涵，刘丽秋

(青岛大学附属医院 肾病科，山东 青岛266003)

Klotho基因是于1997年被发现的一种“抗衰老”基因，表达在多种组织，如肾脏、甲状旁腺、脑、卵巢、胰腺等，肾脏(主要是肾小管上皮细胞)和脑脉络膜为其高表达部位[1]。Klotho基因编码的klotho蛋白(KL)有膜型及分泌型两种形式，膜型KL(mKlotho)是I型跨膜蛋白，主要作为纤维细胞生长因子-23(FGF-23)的协同受体发挥钙磷代谢调节作用[2]；分泌型KL(sKlotho)可以在血液及体液中被检测到，其除了具有mKlotho的钙磷调节作用外，还具有抗氧化应激、抗炎症反应、抗细胞凋亡、抗纤维化及抑制血管钙化等多种保护功能[3]。动物实验提示肾脏klotho基因表达的下调在血管紧张素II(Ang II)诱导的肾脏损害中起重要作用[4]。Ang II受体拮抗剂(ARB)可以阻断Ang II与AT1受体结合从而阻止血管收缩，减少血管加压素和醛固酮释放，减少肾脏水钠重吸收，减缓心脏血管、肾脏细胞的生长，但其在减少尿蛋白、延缓肾病进程的作用及具体机制方面的研究较少。奥美沙坦酯是临床中常用的ARB类药物，本研究将阿霉素肾病模型大鼠作为研究对象，探讨奥美沙坦酯对阿霉素肾病大鼠KL表达及氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1一般材料 清洁级雄性Wistar大鼠35只,体质量240±12 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号 SCXK(京)2016G006,饲养于青岛大学医学院动物房。

1.1.2仪器试剂 盐酸阿霉素(MedChemExpress),奥美沙坦酯[第一三共制药(上海)有限公司],兔抗鼠anti-klotho多克隆抗体(英国Abcam),β-actin(北京 博奥森),Trizol试剂(美国Invitrogen),cDNA 反转录试剂盒和RT-PCR试剂盒(北京 Takara)，免疫组化试剂盒(北京 中杉金桥),DAB显色试剂盒(福州 迈新),苏木精-伊红染色试剂(北京 索莱宝),Olympus AU640日立全自动生化分析仪(日本Olympus公司)。

1.2 试验方法

1.2.1阿霉素肾病模型建立及实验动物分组 大鼠适应性喂养1周后，随机分为模型组(25只)和正常对照组(NC组)(10只)。模型组给予一次性尾静脉注射阿霉素6.5 mg/kg造模,对照组大鼠注射等体积的生理盐水。存活的大鼠造模1周后放入代谢笼留取24 h尿，测定尿蛋白含量。模型组24 h尿蛋白>100 mg/24 h，提示造模成功。共有22只大鼠造模成功，随机将模型组分为阿霉素肾病组(ADR组)、奥美沙坦酯干预组(OLM组)，每组11只。

1.2.2给药方法 造模成功后，OLM组每日给予奥美沙坦酯10 mg/(kg·d)灌胃[5]，NC组与ADR组每日给予等量生理盐水灌胃。每日灌胃连续8周，每周称重1次，调整药物用量。试验期间各组大鼠分笼喂养，标准饮食，自由饮水。

1.2.3标本的制备 连续灌胃8周后，各组大鼠放入代谢笼，留取24 h尿液，测定尿蛋白含量。标本的收集过程中及时清理黏附在代谢笼内壁的食物残渣和大鼠粪便，以排除其对尿蛋白定量测定的影响。用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔麻醉，下腔静脉取鲜血3-5 ml，3 000 r/min离心10 min后取血清移入EP管中，-20℃保存；同时取出双侧肾脏组织，左侧肾脏由液氮冷藏快速转移至-80℃冰箱，留作West blot和实时荧光定量PCR(q-PCR),右侧肾脏组织放入10%中性甲醛转移至4℃冰箱保存，用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色。

1.2.4一般项目的检测 观察各组大鼠精神状态、摄食、大小便、体型等。全自动生化分析仪检测大鼠24 h尿蛋白、血清白蛋白、甘油三酯、总胆固醇、尿素氮、肌酐水平，以上实验重复3次，取均值。

1.2.5Klotho mRNA、KL、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平的测定 取-80℃冰箱保存的左侧肾组织，采用q-PCR检测KL mRNA的表达；Western blot检测KL的含量，用ImageJ软件分析KL的相对表达量；采用羟胺法检测大鼠肾组织中SOD活性,比色法检测MDA含量。以上检测均严格按照试剂盒说明进行操作。所有实验重复3次,取均值。

1.2.6组织病理学观察 取4℃冰箱保存的右侧肾组织，包埋制成3 μm石蜡切片，切片脱蜡、复水后经苏木精-伊红染色、脱水、透明、封片,光镜下观察肾小球和肾小管间质形态学改变。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 一般情况

造模后NC组精神状态、饮食、大小便、体重等生长发育情况良好；ADR组及OLM组逐渐出现精神萎靡、脱毛、体重减少、阴囊水肿等症状，ADR组较OLM组症状明显，至第8周，ADR组大鼠死亡2只。

2.2 各组大鼠24 h尿蛋白及血清生化指标测定

与NC组相比，ADR组、OLM组24 hUPr、TC、TG明显升高，ALB明显降低，且ADR组差别更明显，差异具有统计学意义(P<0.05)；三组间BUN、SCr水平差异无统计学意义(P>0.05)(见图1)。

2.3 各组大鼠KL mRNA、KL表达和氧化应激因子水平

如图2所示，与NC 组相比，ADR组、OLM组大鼠肾组织中KL mRNA的表达和SOD活性明显降低，MDA水平上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；与ADR组相比，OLM组大鼠肾组织中KL mRNA的表达和SOD活性明显升高，MDA水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot(图3)显示：ADR组及OLM组肾组织KL表达均低于NC组，但OLM组KL表达高于ADR组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组大鼠24 h尿蛋白、血清生化指标水平

图2 各组大鼠KL mRNA表达、SOD活性及MOD水平

图3 各组大鼠大鼠肾组织KL的表达量

2.4 24hUPr与KL表达、SOD活性、MDA水平的相关性

24hUPr与KL水平呈负相关(r=-9728,P<0.0001)，与SOD活性呈负相关(r=-0.9766.P<0.0001),与 MDA含量呈正相关(r=0.9322,P<0.0001) (见图4)。

2.5 各组大鼠肾脏形态变化

如图5，HE染色结果显示，NC组肾小球、间质形态基本正常；ADR组可见球囊粘连，伴系膜区扩大、基质增生，肾小球硬化明显，肾小管上皮细胞明显萎缩,可见空泡及颗粒变性,肾小管内可见蛋白管型,间质血管肿胀明显，间质内可见炎性细胞浸润；OLM组大鼠肾小球病理改变较ADR组明显减轻。

3 讨论

阿霉素肾病模型大鼠的病理改变类似于人类局灶节段性硬化(FSGS)引起的慢性进展性肾脏病[6]，临床上主要表现为持续性大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症、水肿及腹水等，是目前公认的能较好模拟人类慢性肾脏病的动物模型，被广泛应用于研究慢性肾病潜在的机制及治疗策略[7]。

Aizawa等[8]报道在慢性肾病中，肾脏klotho基因的表达呈下调趋势，这提示KL可能是作为一种肾脏的保护性因子，参与了延缓慢性肾病的进展。本实验中，ADR组及OLM组大鼠与NC组相比，KL表达量明显降低，24hUPr、TC、TG明显升高，肾小球、间质病变明显，OLM组较ADR组上述改变明显减轻，这与Aizawa的研究结果相一致，KL确实可以延缓肾病的进展。多项国内外研究显示，KL对肾脏的保护作用主要体现在以下几个方面：①调节钙磷代谢：近年来有研究表明,FGF-23/KL轴在慢性肾脏病矿物质与骨代谢中起着关键的作用,FGF-23通过KL发挥生物学作用[9]。②抗氧化应激：关于KL抑制氧化应激的研究发现，sKlotho能够通过增强SOD的表达，减少ROS的产生，从而抑制氧化应激。也有研究[10]指出，胰岛素/胰岛素样生长因子-1(insulin/insu1in-like growth factor-1,IG-1)调控的FoxO蛋白是KL的靶点之一。有动物研究结果表明，KL-FoxO-SOD-ROS是肾脏内抗氧化应激的信号机制[11]。本实验中，OLM组大鼠较ADR组KL表达、SOD活性明显升高，MDA明显降低，提示KL能够增强SOD的表达，抑制氧化应激，与已有相关研究结果相同，但其是通过KL-FoxO-SOD-ROS途径，抑或通过其他尚未发现的途径，发挥抑制氧化应激作用，仍需进一步验证。③抗炎症反应：Zeng等[12]的研究证实，在衰老导致的肾脏损伤和炎症反应中，高表达的KL能够通过调控RIG-I/NF-κB信号通路来实现抗炎作用。④抗凋亡作用：在急性肾损伤的动物模型研究中显示，给予外源性的sKlotho，能够显著抑制肾小球细胞的凋亡，这一作用可能是通过增强热休克蛋白70(Hsp70)的表达来实现的[13]。⑤抗纤维化：国内学者证实补充外源性KL或上调KL的表达可以显著延缓肾间质纤维化的进程。研究表明KL可能通过影响MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达而调控ECM降解过程，也可能通过抑制TGF-β1与其II型受体的结合，抑制TGF-β1的信号转导通路[14]，进而减缓肾间质纤维化的进程。KL还可以抑制Wnt/β-catenin[15]、ERK1/2-p38[16]激酶信号转导途径，抑制肾组织纤维化。⑥抑制血管钙化：KL通过加强FGF-23活性促进肾脏对磷的排泄，调节磷代谢，延缓血管钙化的发生[17]；体外实验证明，KL也可以直接抑制磷诱导的血管平滑肌细胞钙化，阻碍血管平滑肌细胞向成骨细胞的转化[18]。

图4 24hUPr与KL表达、SOD活性、MDA水平的相关性

图5 各组大鼠肾脏HE染色(×400)

目前KL水平降低的原因尚不完全清楚，可能与氧化应激损失、微炎症状态、钙磷代谢紊乱、Ang II的作用及血管内皮功能紊乱等有关。Ishizaka等[19]认为Ang II介导了KL的表达下调，且该作用是Ang II 1型受体依赖性的。奥美沙坦酯是一种新型的ARB类药物，通过选择性阻断Ang II与血管平滑肌AT l受体的结合而阻断Ang II，口服后在小肠内完全去酯转化为活性代谢产物奥美沙坦，不需经过肝细胞色素CYP-450酶代谢。奥美沙坦可以与AT1受体的2个位点结合，一个是-OH组，另一个是-COOH组，即所谓的“双链占领”，而其他的ARB类其他药物只能与AT1的-OH组结合[20,21]。奥美沙坦酯高度选择性决定了其与AT1受体的高亲和力和持久稳定的作用，因其独特的药代动力学和药效动力学特性而被广泛应用于临床。研究表明,肾脏RAAS的过度激活与许多肾脏疾病有关,RAAS过度激活的主要效应包括氧化应激、NF-κB激活、纤维母细胞增殖等[22]。OLM组较ADR组24hUPr、TC、TG水平明显降低，且肾脏病理改变明显减轻，证实奥美沙坦酯可以降低尿蛋白，减缓大鼠肾脏损害进展。有研究[5，23]显示，ARB类药物可提高大鼠KL的表达,抑制氧化应激。本实验中，OLM组大鼠较ADR组KL表达上调，SOD活性明显升高，MDA水平明显降低，氧化应激反应明显减弱。综上，OLM很可能是通过上调KL的表达，抑制氧化应激，从而延缓肾病的进展。

众多研究[24]显示，在慢性肾脏病的早期即可检测到KL的降低，而且随着肾功能不全的进展，其降低趋势也越发明显。KL的减少在一定程度上反映了CKD患者肾脏损伤的程度，有可能作为肾功能损伤的血清学标志物。同时，KL的减少在一定程度上促进了慢性肾脏病患者病情进展，有可能成为CKD患者预测肾功能恶化的标志物之一。关于KL延缓肾脏疾病进展的具体机制、通路研究极其重要，奥美沙坦酯如何上调KL表达，改善肾脏功能的具体机制目前尚不明确，还需进一步的研究。