反复种植失败人群年龄、BMI与非整倍体的关系分析

罗燕群 李辉斌 黄翠玉 黄莉 朱秀兰 张曦倩 刘风华

(广东省妇幼保健院 生殖医学中心，广东 广州 511442)

随着年龄增加卵子质量下降，非整倍体率增加[1,2]，故高龄成为胚胎植入前非整倍性基因测试(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)的临床指征之一。除了高龄是非整倍体发生的高危因素，另外也有基础实验发现肥胖小鼠的卵母细胞显示减数分裂异常或延迟[3]，高脂饮食小鼠的卵母细胞表现出纺锤体缺陷，染色体错位和非整倍性发生率更高[4]。因此，近年来体重的改变对生殖的影响也备受关注，研究发现超重和肥胖患者其内分泌以及代谢的改变导致不孕症、自然流产、体外受精-胚胎移植助孕不良的妊娠结局以及产科并发症增加[5-9]。国外研究发现随着身体质量指数(body mass index，BMI)增加，体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)助孕低反应周期取消率增加，妊娠率降低，但是在接收赠卵的肥胖受体的荟萃分析发现BMI增加不会影响IVF-ET结局，表明卵母细胞质量是影响肥胖患者IVF/ICSI结局的关键因素[10, 11]。但是临床上妇女体重的异常是否会引起胚胎非整倍体率增加导致妊娠率降低？目前此方面研究尚少，本研究先通过分析反复种植失败不同年龄组以及不同体重指数组患者的非整倍体率的差异，再进一步在不同年龄段分层分析不同体重指数患者的非整倍体率的情况，希望给反复种植失败患者PGT-A助孕前的遗传咨询提供有用的信息。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2017年5月至2020年6月在广东省妇幼保健院诊断为反复种植失败行PGT-A的79个周期资料。入选标准：①取卵年龄≤39周岁；②诊断为反复种植失败的患者，即既往至少3次或以上移植周期(包括新鲜或者冻融胚胎)，累积移植大于等于4个优质胚胎；③均为新鲜PGT-A周期。排除标准：①男女双方染色体核型异常；②输卵管积水；③子宫畸形；④中、重子宫粘连的电切术后；⑤女方抗心磷脂抗体阳性或者凝血功能异常。广东省妇幼保健院的伦理委员会审核并批准本研究，参与患者均知情并签署同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 分组 按取卵年龄分<35岁组和35～39岁组，按BMI分体重过低组(<18.5kg/m2)、正常组(18.5～23.9kg/m2)和超重组(24.0～27.9kg/m2)[12, 13]。

1.2.2 控制性促排卵以及PGT-A胚胎培养和活检 采用常规的促排卵方案，当1个卵泡直径≥20mm或者3个以上卵泡直径≥18 mm时，注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)6000～10 000U诱导排卵，诱发排卵后36h取卵。取卵后4～6h常规行卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，然后采用序贯培养(vitrolife G-series)胚胎至第5天或第6天，活检时间为受精后第5或第6天，活检部分外胚层细胞(5～10个)送检。活检后的囊胚常规冷冻保存。

1.2.3 PGT-A检测 利用胚胎植入前染色体非整倍体检测的试剂盒(可逆末端终止测序法)进行测序检测(嘉宝仁和，北京)，再采用SurePlex扩增的试剂盒(Rubicon 公司，美国)对常规活检的5～10个滋养外胚层细胞进行全基因组扩增，然后通过基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing，CNV-seq)分析方法对扩增后的产物进行检测以及数据分析[14]。

1.2.4 PGT-A胚胎检测数据分析以及判读标准 整倍体囊胚检测结果中没有出现整条染色体异常和片段性异常(>4 Mb)及嵌合情况。非整倍体囊胚：当23对染色体中任意一条染色体检测结果与参考数据库中对应的正常染色体存在显著差异，即该条染色体拷贝数异常(包括嵌合情况)。整倍体数=诊断囊胚数-非整倍体数。

2 结果

2.1 ≤35岁和35～39岁反复种植失败患者PGT-A助孕的临床特征以及非整倍体的比较 <35岁患者的BMI、腰围、腰臀比、抗苗勒管激素、成熟卵数、囊胚形成数、活检囊胚数、嵌合体率均和35～39岁患者间差异无明显统计学意义(P>0.05)，但胚胎整倍体数、整倍体率明显高于35～39岁患者(P<0.05)。见表1。

表1 <35岁和35～39岁患者的临床特征和非整倍体比较

2.2 不同体重指数的反复种植失败患者行PGT-A助孕的临床特征以及非整倍体的比较 不同BMI组间(<18.5、18.5～23.9和24.0～27.9)患者的年龄、基础FSH、抗苗勒管激素、获卵数、成熟卵数、2PN卵裂数、活检囊胚数间差异无明显统计学意义(P>0.05)，体重指数18.5～24.0组患者正常受精率、囊胚形成率明显高于其他2组，差异有统计学意义(P<0.05)，但是其胚胎整倍体数、整倍体率和嵌合体率三组间差异无明显统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同BMI患者的临床特征和非整倍体的比较

2.3 小于35岁和35～39岁不同体重指数的反复种植失败患者PGT-A助孕的临床特征以及非整倍体的比较 不同年龄段(年龄<35岁和34～39岁)患者分别统计不同体重指数组间(<18.5kg/m2、18.5～23.9kg/m2和24.0～27.9kg/m2)患者的年龄、活检囊胚数、胚胎整倍体数、整倍体率和嵌合体率3组间差异无明显统计学意义(P>0.05)。35～39岁年龄阶段的患者体重正常患者囊胚形成率高于体重过低和超重患者，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 ≤34岁和35～39岁不同BMI患者的临床特征和非整倍体的比较

3 讨论

肥胖不仅导致心血管和脑血管疾病、糖尿病、睡眠呼吸暂停、关节炎和癌症等风险增加[15, 16]，而且影响女性的生殖功能，超重同样产生不良影响。国外研究分析了超重或肥胖对IVF/ICSI助孕结果的影响提示即使 BMI ≥25kg/m2也与IVF/ICSI治疗的妊娠率降低和自然流产率增高有关[6][11, 17]，以及超重导致种植率明显降低[18]。也有针对35岁以下IVF助孕患者的研究发现肥胖影响胚胎质量[19]。非整倍体是自然流产以及反复种植失败发生的主要原因之一[20]。随着年龄的增加非整倍体率增加，2018版的胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识提出高龄≥38岁、不明原因反复自然流产以及不明原因反复种植失败妇女建议行PGS(即PGT-A)助孕筛查整倍体胚胎移植[21]。反复种植失败患者中年龄和非整倍体的关系如何？BMI的异常与非整倍体的发生是否相关？本研究针对性先分析了反复种植失败患者PGT-A助孕<35岁和≥35～39岁患者非整倍体率的差异，再进一步分析不同体重指数患者非整倍体的差异。

3.1 不同年龄段反复种植失败患者PGT-A助孕非整倍体的分析 由于导致不明原因性反复种植失败的机制复杂，PGT-A筛选整倍体胚胎移植以及提高子宫内膜容受性均认为是其治疗的主要措施，但如何针对予以行之有效的措施尚有争议,尤其近期对PGT-A的临床意义提出了新的质疑以及其指征也面临修改和更新[21-24]。遭遇不明原因性反复种植失败的患者选择行PGT-A助孕的利弊如何？国外研究发现<35岁、35～37岁、38～39岁和40岁以上囊胚非整倍体的概率分别为40.3%、50.8%、56%和78.3%[2, 25]。国内一项针对不同年龄组女性胚胎的非整倍性情况分析发现>35岁的高龄女性胚胎染色体异常率高于低龄女性[26]，本研究与上述研究一致，我们针对反复种植失败PGT-A助孕患者研究发现<35岁和35～39岁组的囊胚形成率相似，但是整倍体率差异具有明显统计学意义，分别为61.1%和47.0%。因此，遗传咨询时，针对性提供患者相应年龄段囊胚可能获得整倍体胚胎的概率，可给患者选择是否行胚胎植入前遗传学筛查提供帮助。

2.2 不同体重指数反复种植失败患者PGT-A助孕非整倍体的分析 国外研究结果提示超重或肥胖对生殖系统的不良影响可能与胚胎非整倍性无关[12]。由于国外与国内人种的不同，同时肥胖以及超重的诊断标准和发生概率也有差异，因此我们也针对体重指数与非整倍体的关系进行研究。但由于地理位置关系，本中心就诊的中国南方地区不孕的肥胖妇女比较少，尤其是因反复种植失败行PGT-A的不孕妇女，因此本研究重点探讨体重过低、体重正常和超重的反复种植失败患者PGT-A助孕周期非整倍体的差异。本研究中无论是否以年龄分层分析得出的结果均与国外研究一致，认为不同BMI组患者的非整倍体率相似。研究证实卵裂期胚胎的整倍体率是33.3%，明显低于囊胚的整倍体率60.3%[27]，我们研究发现35～39岁年龄段的体重正常患者囊胚形成率明显高于体重过低和超重患者，分析认为囊胚培养过程中一些发育潜能差的胚胎(包括一些非整倍体胚胎)被淘汰[28]，与Goldman等[12]研究结果一致认为超重或肥胖对体外受精-胚胎移植助孕结果的负面影响可能是与胚胎非整倍体以外的因素有关。因此我们研究认为虽然体重指数异常可能不影响非整倍体的发生，但是35～39岁的反复种植失败患者行PGT-A助孕前控制体重指数至正常范围可能会通过提高囊胚形成率增加整倍体胚胎个数。

胚胎非整倍体的发生与众多因素相关，例如产妇年龄，精子质量和卵母细胞的体外操作等[24]，另外本研究为回顾性队列分析且样本量有限等因素可能会对非整倍体的统计分析产生偏倚，因此尚需要设计良好的前瞻性随机临床试验进行证实。

综上所述，当反复种植失败患者年龄增加至35～39岁时整倍体率明显降低以及体重指数的异常可能影响囊胚形成率。超重以及体重过低可能不影响反复种植失败患者的非整倍体率。