516例无精症Y染色体微缺失及细胞遗传学分析

吴丽华 胡晶晶 梁凯玲 张忆聪

(广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 511442)

全世界大约有10%～15%的育龄夫妇不育，世界卫生组织认为不育夫妇中的50%都由男性因素引起的[1]，而在男性不育中无精症和隐匿性无精症占10%～20%。引起男性无精症的原因有遗传学异常、性激素水平异常、免疫异常、年龄和环境等因素。染色体异常及Y染色体微缺失是男性不育症患者重要的遗传学病因，也是目前临床上最关注的遗传学异常。该病因学检查有助于临床采取相应治疗措施或辅助生育技术，减少患者经济负担。本文通过回顾性分析了516例无精症的患者的染色体核型和Y染色体上的无精因子(azoospermia factor，AZF)微缺失检测结果，探讨Y染色体微缺失和细胞遗传学分析在无精症中发生的频率以及它们之间的相关性，帮助明确无精症患者的遗传学病因。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集自2015年3月至2019年12月近5年来广东省妇幼保健院生殖健康与不育症科诊断为无精症的患者共516例，年龄21～52岁，平均年龄31.7岁。所有的患者均通过体检和精液常规分析检查，排除精索静脉曲张、内分泌紊乱、生殖道炎症、免疫异常和理化等引起无精的因素。无精子症的诊断标准按照世界卫生组织第5版《人类精液检查与处理实验室手册》[2]的定义及方法，检查精子密度至少3次或3次以上，且精液离心后也未见精子。

1.2 方法

1.2.1 细胞遗传学分析 患者签署知情同意后，抽取肝素抗凝外周血4ml，常规进行淋巴细胞培养72h，常规制备染色体，G显带，计数20个核型，分析5个核型，有数目异常者加倍计数及分析，染色体命名参考根据《人类细胞遗传学国际命名体制2016》[3]。

1.2.2 Y染色体微缺失检测 抽取患者EDTA-K2抗凝外周血2ml，提取基因组DNA，选择Y染色体AZF上6个STS序列，分别是AZFa:SY84、SY86，AZFb:SY127、SY134，AZFc:SY254、SY255，以SRY(SY14)和ZFAX/Y位点为内对照同时进行扩增，PCR引物末端FAM、JOE和TAMRA荧光基团标记[4]。除ZFX/ZFY引物外，其他引物和扩增条件按照参考欧洲男科学会(European Academy of Andrology，EAA)2004版指导原则和欧洲分子基因诊断质量联盟(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)标准进行[5]，最后使用GeneMaker(version2.2.0)软件对毛细管电泳结果进行数据分析。

2 结果

2.1 细胞遗传学分析 516例无精症患者中共检出染色体异常患者66例，检出率12.8%(66/516)。检出性染色体异常57例(86.36%，57/66)，包括性染色体结构异常4例、性染色体数目异常44例、46,XX性别发育异常4例和嵌合体9例；检出常染色体结构异常9例(13.64%，9/66)。详见表1。

2.2 Y染色体微缺失检测 检出AZF缺失40例，总缺失率为7.8%(40/516)，包括5例AZFa(12.5%，5/40)、1例AZFb(2.5%，1/40)、20例AZFc(50.0%，20/40)、9例AZFb+AZFc(22.5%，9/40)、4例AZFa+AZFb+AZFc(10.0%，4/40)。详见表1。

2.3 Y染色体微缺失患者中的细胞遗传学分析 40例Y染色体微缺失中检出正常核型27例(67.5%，27/40)，异常核型13例(32.5%，13/40)，异常核型包括46,X,del(Y)(10.0%，4/40)、性染色体嵌合体(12.5%，5/40)和46,XX(10.0%，4/40)。详见表1。

表1 染色体核型和Y染色体微缺失检出率及分布

3 讨论

在男性无精症的遗传病因中，染色体核型异常和Y染色体AZF微缺失是2个常见的遗传因素。染色体Y染色体长臂q11区存在AZF，其含有3个互不重叠的AZFa、AZFb、AZFc区域组成[6]，为调控精子发生的基因位点，一个或多个区域的缺失可引起生精功能障碍，导致男性无精症。本研究516例无精症患者中异常核型检出率为12.8%，与Fu[7]报道的14.71%相近。我们发现无精症患者中最常见的异常核型是47,XXY，占异常核型的49.4%，与Zhang[8]报道的51.14%相一致。Klinefelter综合征即先天性睾丸曲细精管发育不全，Y染色体上存在控制睾丸发育的SRY基因，表型为男性，但是由于患者核型中多余的X染色体导致Y染色体功能受到抑制，使睾丸曲精管发育受到影响，生精小管玻璃样变和纤维化。临床表现无精子，且有睾丸小而质硬和第二性征发育异常。刘兴章等[8]报道的无精症或隐匿性无精症患者中检出的165例47,XXY，未发现Y染色体AZF微缺失。本文39例47,XXY中也未检出AZF微缺失，提示47,XXY患者的无精症病因与Y染色体微缺失无明显相关性。因此，对于Klinefelter综合征患者可能没必要进行AZF基因微缺失检测。

国内外研究发现常染色体上存在2000多个与精子生成有关的基因[7]。一些研究发现1号染色体存在与生精功能相关的基因，包括SCP-1、tsMCAK、MTHFR、MSH4和MMP-23[9，10]。本文检出的常染色体异常9例，均无AZF微缺失，其中1号染色体最常见，包括3例倒位和1例平衡易位，占常染色体异常的44.4%。有研究在男性不育症，尤其是无精症患者中1号染色体断裂位点数相比其他常染色体要高[11]。可见1号染色体的结构异常可能与患者的无精症具有高度相关。原因可能是1号染色体发生易位或倒位后，这些断裂的位点如果位于生精功能的形成的相关基因，破坏了该基因的完整性，影响基因表达进而引发生精障碍，其发生机制有待日后进一步深入研究。

本文检出AZF总缺失率为7.8%，与Ferlin[12]报道的相近。AZF至少可分为a、b、c 3个区域，分别位Yq11.23的近、中、远端。AZFa缺失可导致唯支持细胞综合征，病理检查表现为间质细胞及支持细胞减少，精曲小管发育不良；AZFb缺失则会导致精原细胞和初级精母细胞成熟发育障碍，表现为无精；AZFc缺失则比较复杂，可以出现有正常精子到无精症的表型。本文发现无精症中AZFc异常率为50%，为最常见的缺失类型，其次为AZFb+AZFc(22.5%)、AZFa(12.5%)、AZFa+AZFb+AZFc(10.0%)和AZFb(2.5%)。以上涉及到AZFa和AZFb单个或多个区域的缺失无法获得精子，AZFc缺失的无精症患者则可以通过睾丸穿刺而获成熟精子，借助卵细胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)生育后代[13，14]，但AZF缺失也有通过垂直传播给男性子代的风险。因而，早期发现是否存在AZF缺失及缺失区域，为男性无精症患者日后是否选择通过ICSI辅助生育治疗提供了科学依据，与此同时为AZFc缺失的患者行ICSI治疗前遗传诊断选择女性胚胎提供了遗传咨询，减少非必要的有创手术，减轻患者的心理压力和经济负担。

40例AZF缺失患者中正常核型占65%，刘兴章等[15]也报道了997例无精症患者中有71.6%正常男性核型，可见AZF缺失中正常核型比例高。一般来说AZF微缺失很难通过染色体核型检测发现，因此，对无精症患者染色体核型正常的患者有必要再进一步行AZF基因的检测。

决定睾丸曲细精管生精细胞发育的关键基因存在Y染色体q11位置，该部分缺失或重排可能导致了Y染色体上一系列与生精子功能的相关基因缺失或改变。我们检出4例核型为46,XY,del(Y)(q11.22)，细胞遗传学上Y染色体长臂有明显的缺失。同时涉及到不同区域的AZF微缺失，1例AZFc区缺失、2例AZFb+AZFc区缺失、1例AZFa+AZFb+AZFc区缺失。4例患者染色体核型Y染色体缺失定位于q11.22位置，分子水平表现出不同AZF的缺失，表明细胞遗传学上对Y染色体长臂q11.22缺失的无精症患者AZF微缺失的可能性大，且缺失的区域需要分子遗传学确认。

综上所述，染色体异常和Y染色体微缺失是影响男性无精症的重要遗传因素。AZF微缺失的无精症患者大多核型正常，常规细胞遗传学不能直接反应AZF微缺失情况，必需通过分子学水平明确诊断。2种方法联合检测有助于在接受辅助生育治疗前的无精症患者明确遗传学病因，从而减轻患者心理负担和避免不必要的临床治疗。