Wnt3a在小鼠黑色素细胞中的表达研究

赵园园，孟金柱

（铜仁学院 农林工程与规划学院，贵州 铜仁 554300）

1 引言

黑色素在黑色素细胞的黑素小体中合成，并转运到邻近的角化细胞，使皮肤和毛发呈现出颜色。黑色素细胞是由神经嵴细胞分化而来的，中间经历黑色素母细胞和黑色素干细胞，其中黑色素母细胞需迁移至表皮及毛囊，黑色素干细胞需要迁移到毛母质区分化成黑色素细胞，或定居于毛囊外根鞘 Bulge 区作为储存库[1]。

神经嵴细胞向黑色素细胞的分化主要受 Wnt信号通路和BMP信号通路的调控[2]。其中，Wnt家族的蛋白是分泌型糖蛋白，通过细胞表面受体介导调控发挥作用[3]。Wnt3a 作为 Wnt 家族的成员之一，通过与黑色素细胞表面的受体FZD结合，在促进神经嵴细胞向黑色素细胞的分化、黑色素的合成过程中起重要作用[4]。

先前的研究表明，Wnt3a 在黑色素细胞外，通过与细胞表面的受体结合发挥作用，但对其在黑色素细胞内的作用研究较少。本研究培养小鼠黑色素细胞，通过免疫荧光技术对黑色素细胞中Wnt3a 蛋白进行定位研究，为进一步探究 Wnt3a在色素沉积中的作用提供基础。

2 材料与方法

2.1 材料

本研究所用小鼠黑色素细胞由山西农业大学羊驼生物工程实验室提供。

2.2 方法

2.2.1 细胞培养 细胞的复苏、培养、传代、冻存方法参照MiR-27a-3p对黑色素生成的作用及机制研究[5]。

2.2.2 免疫荧光 当培养的黑色素细胞密度达到80%左右时，进行传代，传代细胞均匀平铺于铺有经1%盐酸处理的盖玻片的6孔细胞培养板中，待细胞长满，弃培养基，灭菌的PBS清洗细胞3次，以去除死细胞。4%多聚甲醛低温固定30 min，取出盖玻片，PBS洗3次，每次3 min，0.5%TritonX-100室温20 min，BS洗3次，每次3 min，室温下用山羊血清封闭30 min，滴加 Wnt3a抗体（ab219412，abcam，1：200 稀释）湿盒中4℃ 过夜孵育，复温30 min，PBST洗3次，SABCFITC（山羊IgG）（1：100，博士德）37℃ 孵育1 h，PBST 洗 3次，吸干水，抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下用蓝光激发荧光，观察，采集图像。

3 结果

3.1 小鼠皮肤黑色素细胞生长状况

待小鼠皮肤黑色素细胞生长至密度为 80%左右时，显微镜下观察其形态结构，发现细胞排列紧密，呈鹅卵石状，细胞有1～3个突起。细胞排列密集时，突起减少，分布稀疏时，细胞突起明显且较多（见图 1）。

图1 小鼠黑色素细胞

3.2 Wnt3a 在小鼠皮肤黑色素细胞中的表达

图2 Wnt3a在绵羊皮肤黑色素细胞中的表达定位

通过免疫荧光检测发现，Wnt3a 在小鼠皮肤黑色素细胞中有表达，且表达部位主要集中在细胞核附近，其他部位表达量较少（见图 2）。

4 讨论

本研究通过免疫荧光技术对成熟的皮肤黑色素细胞中 Wnt3a 的表达进行研究，结果表明，Wnt3a 蛋白在成熟黑色素细胞中表达，这与笔者先前通过QRT-PCR 和 Western Blot检测结果一致，Wnt3a在小鼠皮肤黑色素细胞中表达[5]。郭海英通过免疫组化检测小鼠毛囊 Wnt3a的表达，发现在小鼠毛囊的生长期，毛球部的黑色素细胞表达 Wnt3a[1]。宋云飞检测不同毛色羊驼皮肤中 Wnt3a 的表达，也发现其在毛球部和根鞘表达，这些结果也与本研究结果相契合[6]。

Wnt3a可以促进神经嵴细胞分化为黑色素细胞，且在黑素色生成过程中发挥积极作用，但 Wnt3a 抑制成熟黑色素细胞的增殖[7]。Wnt/β-catenin 信号通路需要与受体结合发挥作用，Wnt3a已知的受体包括Fzd1、Fzd3、Fzd8和LRP6[4,8,9]。在黑色素合成过程中，Wnt3a主要通过上调 Mitf、Tyr、Tyrp1 的表达，从而增加酪氨酸酶活性和黑色素合成[7]。