食线虫真菌Duddingtonia flagrans冻干制剂低温保存后体外杀虫效果研究

岑曼益，蔺国珍，罗斌汉，王逢会，蔡葵蒸＞

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.延安大学医学院，陕西 延安 716000）

家养反刍动物的消化道线虫是全世界普遍发生的主要寄生虫病，对畜牧业生产造成严重的经济损失。长期以来，随着驱虫药的广泛使用，目前体内寄生虫对常用三大类驱虫药（苯并咪唑类、阿维菌素/伊维菌素、左旋咪唑）的抗药性频繁发生且在一些国家和地区流行并呈蔓延之势[1-3]。为了阻止寄生虫抗药性的继续传播，人们探讨利用线虫的天敌进行生物防治[4]。食线虫真菌在自然界中作为线虫的天敌而存在，其中D.flagrans在培养期间能够产生大量双层壁的厚垣孢子，能够抵抗动物消化道内的消化酶而不被灭活[5]。目前在国外，D.flagrans作为动物胃肠线虫生物防治的候选菌种，已取得具有应用前景的成果[6]。研制适宜的剂型对于家畜寄生线虫的生物防治是非常重要的，这就要求不仅要保持D.flagrans孢子具有稳定的活性传递到动物的粪便中发挥有效地捕杀L3作用，而且需适合于投放至饲料中便于饲用、保存和运输。本研究将D.flagrans厚垣孢子冻干制备成一种生防产品，测定其对动物寄生线虫的捕杀能力，以便为将来生产中应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

捕食线虫性真菌D.flagrans分离株（SDH035）是本实验室自2013年从绵羊粪堆分离纯化获得，GeneBank中18S rRNA、ITS1、5.8 S rRNA、ITS2和28 S rRNA部分序列的登录号为KY288614.1，菌种（菌种编号：CGMCCNO.11210）保存于中国微生物菌种管理委员会微生物中心，实验室日常使用的菌种于2 %玉米粉琼脂（2 % CMA）斜面中4 ℃保存。

1.2 菌种培养及冻干制剂的制备

将保存于2% CMA斜面的培养物，接种于水琼脂（WA）平板的中央，30 ℃恒温培养5 d。经纯净检查合格后，用无菌手术刀切取大小约为4 mm×4 mm的小块，转接于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平皿的中央，30 ℃培养6 d。然后切取PDA上生长的菌块（大小约为4 mm×4 mm）转接于含有120 ml沙堡氏肉汤（pH 6.5），置摇床180 rmp、28 ℃避光振荡培养7 d。将上述培养物旋涡振荡后，取100 ml接种于含有谷物联合培养基的具有细菌滤膜的聚乙烯塑料袋中（玉米660 g，小麦330 g，自来水670 ml，121 ℃高压灭菌30 min），混匀并火焰密封。置于25 ℃恒温培养箱培养21 d，用0.05%灭菌吐温-80洗脱，旋涡振荡2～3 min，两层纱布过滤以除去部分菌丝体，抽样用血细胞计数板计数厚垣孢子的数量，调节厚垣孢子浓度约5×105个/ml，加入与菌悬液等量的冻干保护剂（β-环状糊精），置于真空冷冻干燥机中（FD-1C-50型，北京博医康实验室仪器有限公司），在冷阱温度-45～-50 ℃、真空度8～10 Pa的条件下冻干15 h，先后制备数批样品，密封于疫苗瓶中4 ℃保存备用。

1.3 试验动物

从甘肃省榆中县周围先后购买3～4月龄、体重17～21 kg（平均体重为18 kg）小尾寒羊12只，按照Cai等[7]的方法，每只试验绵羊采用丙硫咪唑和左旋咪唑按推荐剂量联合驱虫1次以驱除动物体内已存在的寄生蠕虫。7 d后将实验室保存的捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）L3经活力检查合格后，每只试验绵羊用改良的灌喂装置（即20 ml注射器连接一个胶管）经口灌服10 000条L3，动物每天饲喂苜蓿干草及少量混合精料，自由饮水。接种21 d后，进行粪便虫卵计数，以确定感染程度，待试验绵羊人工感染成功后备用。

1.4 冻干制剂体外杀虫效果测定

分别取4 ℃保存1年和2年的三批冻干制剂（20161001、20161101和20161102），每批每次测定时用蒸馏水溶解成菌悬液，血细胞计数板计数并调节孢子浓度约为5×105个/ml。用粪袋收集人工感染绵羊粪便，将粪便碾碎后，按照Cai等[7]所描述的方法，称取10 g粪便样品置于直径为5.5 cm平皿中，试验组每个平皿加入2 ml的菌悬液，混合均匀，对照组称取相同量的粪便，加入2 ml蒸馏水（不含真菌）。将上述平皿置于直径为9 cm平皿中并在该平皿底部添加10 ml左右的蒸馏水以保持培养湿度，平皿加盖后，置于28 ℃培养箱培养14 d，期间观察粪便湿度。待培养终止后，按Cai等[8]所描述的方法进行幼虫分离和计数，分别计算各组中所获L3的平均数，杀虫率计算公式如下：

1.5 数据处理

体外试验中，采用SPSS（Version 23.0）软件计算对照组和试验组中L3的平均数，通过方差分析在5%的概率水平判断差异的显著性。

2 结果

三批冻干制剂在4 ℃保存1年时，在体外试验期间，本制剂中D.flagrans孢子在绵羊粪便中能够萌发，试验组中所获得的L3平均数显著地低于对照组，其对绵羊粪便中L3的减少率分别为90.07 %、86.77 %和83.31 %（见表1）。上述冻干制剂在4 ℃保存2年时，试验组和对照组所获得的L3平均数差异仍显著，对绵羊粪便中L3的减少率分别为76.61 %、84.59 %和73.04 %（见表2）。从表1和表2可知，在4 ℃贮存条件下保存1年后随着保存时间的延长，D.flagrans对绵羊粪便中幼虫的捕杀力有下降趋势。

表1 4 ℃保存1年后冻干制剂的体外杀虫试验

表2 4 ℃保存2年后冻干制剂的体外杀虫试验

3 讨论

家畜寄生线虫生防制剂是一种用食线虫真菌制备的、适用于饲喂动物的且含有活菌的新型兽药，目前处于探讨阶段，主要是经动物饲用后在粪便中发挥捕杀幼虫从而减少感染性幼虫的作用。为了使该类产品能够在生产中得到推广应用，因此研究生防制剂剂型、贮藏方法及保存期是十分必要的。

真空冷冻干燥法对保持微生物分离株特性的稳定性有诸多优点，可使微生物存活较长时间[8,9]。但食线虫真菌冻干后作为生防制剂使用，不仅要保持真菌的存活性能，更重要的是要保持其捕食线虫的能力。目前，关于D.flagrans冻干制剂保存期效果尚无研究。笔者对含有D.flagrans海藻酸钠颗粒制剂在4 ℃、-20 ℃、室温和户外贮存1年的保存期进行了测定[10]，该制剂在室温、户外条件下贮存至少可保持6个月的杀虫活性。Braga等[11]评估了保存在硅胶粒中的D.flagrans菌种对马小圆型线虫感染性幼虫（L3）捕杀效果，试验证明在硅胶粒中4 ℃贮存7年仍可存活并对马小圆型线虫L3的具有捕食能力。强力节丛孢菌（A.robusta）的分生孢子冷冻干燥后4 ℃贮存1个月对犬钩口线虫（Ancylotoma spp.）L3体外杀虫率为75.38 %[12]。

综上所述，D.flagrans冻干制剂在4 ℃贮存条件下至少可保持1年有效的杀虫活性，这对于含有活菌的生防制剂产品来说已经达到了应用于生产实践中的条件，但制备冻干制剂成本高，限制了今后在寄生虫生物防治中大规模应用。目前，在一些热带和亚热带家畜寄生虫病常年发生的国家和地区，利用当地分离的D.flagrans分离株研制成的颗粒制剂已进行了田间试验[13]，但大规模生产D.flagrans厚垣孢子的问题在全世界尚未突破。我国当地分离菌株所研制的制剂目前尚未有田间试验的数据，田间试验需收集较长时期EPG和环境中感染性幼虫减少的观察资料。因此，冻干制剂的田间试验需要进一步研究。