胃复春对幽门螺杆菌诱导GES-1细胞恶性转化的保护机制

吕兴 吕高虹 叶冠

摘 要 目的：观察胃复春改善幽门螺杆菌（Hp）致人胃黏膜上皮细胞（GES-1）恶性转化的作用机制。方法：采用Hp感染GES-1细胞建立感染模型，随后加入含不同浓度胃复春的血清进行干预。MTT法考察GES-1细胞的增殖能力，Transwell法观察GES-1细胞的浸润能力，Western bolting法检测细胞中CDX2、COX-2、GC-C、CagA及KLF4表达水平。结果：胃复春可有效抑制GES-1细胞的增殖与侵袭能力，同时下调细胞中CDX2、COX-2、GC-C及CagA的表达，上调KLF4的表达。结论：胃复春可通过介导CagA/KLF4信号通路抑制胃黏膜上皮细胞的恶性转化，削弱其增殖与侵袭能力，减少细胞中CDX2、COX-2及GC-C的含量，有效改善GES-1细胞的肠化生进程，从而发挥其治疗胃癌癌前病变的作用。

关键词 胃复春 幽门螺杆菌 人胃黏膜上皮细胞 肠化生 CagA/KLF4信号通路

中图分类号：R286； R735.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）07-0058-04

Protective effects of Weifuchun on malignant transformation of human gastric mucosal epithelial cells induced by Helicobacter pylori*

LYU Xing1**， LYU Gaohong2， YE Guan1***（1. Central Research Institute， Shanghai Pharmaceutical Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China； 2. School of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the mechanism of Weifuchun in the treatment of the malignant transformation of human gastric mucosal epithelial cells （GES-1） induced by Helicobacter pylori （Hp）. Methods： Hp was added into GES-1 cells culture containing different concentrations of Weifuchun to establish the infection models. The GES-1 cell proliferation was determined by MTT assay. The GES-1 cell invasion was observed by transwell chamber assay and the expression levels of CDX2， COX-2， GC-C， CagA and KLF4 were detected by Western blotting. Results： Weifuchun could effectively inhibit the proliferation and invasion of GES-1 cells， down-regulate the expression of CDX2， COX-2， GC-C and CagA， and up-regulate the expression of KLF4. Conclusion： Weifuchun can inhibit the malignant transformation of GES-1 cells by mediating the CagA/KLF4 signaling pathway， suppress their proliferation and invasion ability and can also reverse the gastric intestinal metaplasia of GES-1 cells by reducing the CDX2， COX-2 and GC-C levels so as to finally treat the gastric precancerous lesions.

KEy WORDS Weifuchun； Helicobacter pylori； human gastric mucosal epithelial cells； gastric intestinal metaplasia； CagA/KLF4 signaling pathway

胃癌（gastric cancer， GC）是一种高发病率、高死亡率的疾病，其發病率在全球常见的恶性肿瘤中高居第4位，死亡率亦高达第2位[1]。“ 正常胃黏膜→浅表性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→异性增生→胃癌”是较为公认的胃癌病变的发展模式[2]，其中肠上皮化生（intestinal metaplasia， IM）被认为是胃癌发生、发展过程中重要的癌前病变[3]。同时，已有研究证实健康人群其胃癌发生风险不到胃黏膜肠化生患者的10%[4]，因此通过逆转胃黏膜肠化生是逆转胃癌发生的重要举措。然而幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， Hp）作为胃癌发生过程中的启发因子，感染机体后可产生较高水平的尿素酶、黏液酶、脂酶及脂多糖等致病因子，通过趋化、黏附，定植于胃黏膜，破坏胃黏膜完整性继而诱发慢性胃炎，推动胃癌的病变进程[5-6]。中国作为Hp感染的首要国家，其感染率高达50%～80%[7]，而大部分患者经过临床常规治疗后出现感染复发[8]，因此迫切需要挖掘更有效、安全的治疗药物，这将对阻断慢性胃炎发展、抑制胃癌发生产生重大意义。

中医药在胃癌前病变方面显示出积极的防治作用[9-10]，而胃复春片作为国家中药保护品种，具有健脾益气，活血解毒等功效，已被批准用于胃癌前病变的治疗。药理研究发现，胃复春具有抑制幽门螺杆菌，改善胃黏膜萎缩等作用活性，在对病变中出现不典型增生及肠上皮化生的临床病理改善方面其产生的有效率高达到66.0%[11-12]，由此明确了胃复春在胃癌癌前病变治疗中的重要价值。目前关于胃复春的研究主要侧重于临床方向，同时其在防治胃癌癌前病变的机制研究尚不充分。为进一步探索胃复春防治胃癌癌前病变的作用及机制，本课题拟采用Hp感染GES-1细胞，建立细胞病变模型，通过分子生物学手段阐释胃复春的治疗机制，为其临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与菌株

人胃黏膜上皮细胞购自中国科学院上海细胞库；幽门螺杆菌（NCTC11637）购自美国标准生物品收藏中心。

1.2 主要试剂与仪器

胃复春片（国药准字Z20040003，杭州胡庆余堂药业有限公司）；MTT（批号S33649，美國Sigma公司）；CDX2、COX-2、KLF4及β-Tubulin抗体（美国Cell signaling Technology公司）；GC-C及Cag A抗体（美国Santa Cruz公司）；全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（南京凯基生物公司）；BCA、ECL试剂盒、Orma371型CO2细胞培养箱及细菌三气培养箱（美国 Thermo Fisher公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；SDS-PAGE电泳系统（上海天能科技有限公司）；Western blot转膜系统、Gel Doc凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；Synergy HT酶标仪（美国BioTeK公司）；ALLEGRA X-15R高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；Olympus AX70显微照相系统（日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞、菌株培养及细胞感染模型的建立

取GES-1细胞进行常规培养，接种在DMEM培养基（10% FBS+1% P/S）中，并置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞融合至80%～90%时传代培养。取Hp活菌（2×107 CFU/ml），将其中100 μl均匀涂抹于布氏改良选择性平板培养基上，并置于85% N2、10% CO2及5% O2培养箱中培养。按常规细胞造模法[13]，在无抗生素条件下细菌-细胞为200∶1的比例共培养。

1.3.2 含药血清制备

根据《药理实验方法学》中人-大鼠用药量及体表面积计算得大鼠的等效剂量为27.22 g/（kg·d），大鼠每日采取5倍量给药，持续7 d。末次给药1 h后腹腔麻醉，腹主动脉取血，37 ℃静置1 h，置入配有TLA-120.1转子的高速冷冻离心机中进行离心分离血清（1 000 r/min，5 min，4 ℃），置56 ℃，30 min灭活处理，过滤、分装、保存。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖率

待GES-1细胞融合至80%～90%时加入含不同浓度胃复春（0、5%、10%、20%）的血清，1 h后加入Hp菌液进行感染。23 h后加入MTT液（5 g/L）20 μl并继续培养。4 h后弃上清，每孔再加入150 μl DMSO振荡10 min 溶解，用酶标仪于490 nm波长处检测吸光度A。按增殖率= （处理组A/空白对照组A）×100%计算细胞增殖率（%）。

1.3.4 Transwell法检测细胞侵袭力

采用Matrigel（1∶8稀释）对Transwell小室底部膜的上室面进行铺胶，凝胶后在上室中加入1×105个GES-1细胞进行培养，随后加入含不同浓度胃复春（0、5%、10%、20%）的血清，1 h后加入Hp菌液进行感染。 23 h后取出小室，4%多聚甲醛固定、风干。0.1%结晶紫染色，显微镜下观察、记数。按侵袭率= （处理组细胞数/空白对照组细胞数）×100%计算细胞侵袭率（%）。

1.3.5 免疫印迹法检测

待GES-1细胞融合至80%～90%时加入含不同浓度胃复春（0、1、5、25 μg/ml）的血清，1 h后加入Hp菌液进行感染。23 h后收集细胞并裂解，取20 μg蛋白，经SDS-PAGE电泳、电转移、5% BSA封闭。加CDX2、COX-2、GC-C、CagA、KLF4及β-Tubulin一抗4 ℃过夜孵育， HRP标记的二抗孵育。ECL化学发光、显影。

1.3.6 数理统计

2 结果

2.1 胃复春对Hp感染后GES-1细胞增殖能力的影响

与空白对照组比较，模型组中GES-1细胞增殖率显著增加（P<0.01）；与模型组比较，在含10%胃复春的血清中培养时可明显抑制GES-1细胞的增殖（P<0.05），在含20%胃复春的血清中培养则可显著抑制细胞的增殖（P<0.01，图1）。

2.2 胃复春对Hp感染后GES-1细胞侵袭能力的影响

与空白对照组比较，模型组中GES-1细胞侵袭能力显著提升（P<0.01）；与模型组比较，在含5%胃复春的血清中培养时可明显抑制GES-1细胞的侵袭（P< 0.05），而在含10%及20%胃复春的血清中培养时则可显著抑制细胞的侵袭，且呈浓度依赖性（P<0.01，图2）。

2.3 胃复春对Hp感染后GES-1细胞中肠化生标志物表达的影响

与空白对照组比较，模型组GES-1细胞中肠化生标志物（COX-2、GC-C及CDX2）的表達水平显著上调（P<0.01）。与模型组比较，在含5%胃复春的血清中培养时明显抑制COX-2、GC-C及CDX2的表达（P<0.05）；在含10%胃复春的血清中培养时可显著减少COX-2及GC-C的表达（P<0.01），明显下调CDX2的表达（P<0.05）；而在含20%胃复春的血清中培养时则可显著降低COX-2、GC-C及CDX2的表达水平（P<0.01，图3）。

2.4 胃复春对Hp感染后GES-1细胞中CagA/KLF4信号通路的影响

与空白对照组比较，模型组GES-1细胞中CagA的表达水平显著上调（P<0.01），而KLF4的表达水平显著下调（P<0.01）。在CagA表达方面：与模型组比较，在含10%及20%胃复春的血清中培养时可显著抑制CagA的表达（P<0.01）；在KLF4表达方面：与模型组比较，在含5%胃复春的血清中培养时可明显促进KLF4的表达（P<0.05），在含10%及20%胃复春的血清中培养时可显著上调KLF4的表达，且存在一定的剂量效应关系（P<0.01，图4）。

3 讨论

已有研究发现，CagA蛋白在Hp感染诱发胃癌的进程中占据重要角色[14]，Hp可将大量CagA蛋白从特异性Ⅳ型分泌系统导入胃黏膜上皮细胞，激活细胞内各类致癌信号，通过加剧细胞增殖、迁移及形态学改变，推动胃癌的发生、发展[15]。而KLF4是GagA信号通路中重要的抑癌因子，具有抑制细胞过度增殖，防止细胞异常分化等作用，可有效抑制GES-1细胞的恶性转化及恶性行为学改变[16]。本实验结果发现，胃复春可通过干扰Hp感染后GES-1细胞内CagA/KLF4信号传导，抑制细胞增殖及侵袭，从而有效防止GES-1细胞的恶性转化。肠上皮化生是胃黏膜上皮细胞恶性转化的重要途径，Hp感染则是其重要的诱导因素[17]，CDX2、COX-2及CG-C作为重要的生物标志物参与了肠上皮化生的病变进程。本研究表明，胃复春可明显下调CDX2、COX-2及CG-C的表达水平，逆转GES-1细胞的肠上皮化生进程，继而发挥其改善胃癌癌前病变的作用。综上所述，胃复春片可通过干预Hp感染的GES-1细胞内CagA/KLF4信号通路，有效逆转GES-1细胞的肠化生进程，削弱细胞增殖与侵袭能力，从而发挥其治疗胃癌癌前病变的作用。通过本次实验可为胃复春片在临床胃癌癌前病变的应用治疗过程中夯实明确的科学依据。

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