癌相关成纤维细胞与食管鳞状细胞癌淋巴转移及淋巴管生成的相关性研究

陈 超，田翔宇，邱 森，王 潼，韩俊雅，陈奎生

食管癌是一种起源于食管黏膜上皮或食管腺上皮的恶性肿瘤，且经淋巴道转移多见，主要分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)两种亚型，这两种亚型的发生、发展机制和病理特征均不相同。根据国际癌症研究署发表的GLOBOCAN 2018研究显示[1]，2018年有57.2万人新诊断为食管癌，同时又有50.9万人死于食管癌，在所有肿瘤中分别排在第七位和第六位。同时，在食管癌患者中还存在明显的地域差异，以东亚地区最为多见，欧美等发达国家相对较少，而中国是食管癌发病大国，根据WHO实时数据，我国食管癌患病率和死亡率都排在全球第五位，但因我国庞大的人口基数，食管癌新发患者和死亡患者都占全球的55%左右，且以食管鳞状细胞癌为主[2]。癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境的重要组成部分，其特异性表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)。有大量证据表明，CAFs在肿瘤的发生、发展和最终扩散中起着重要作用[3]。对食管鳞状细胞癌细胞系的体外研究发现，肿瘤细胞的增殖、血管生成和迁移在很大程度上取决于活化成纤维细胞的存在[4]。本研究采用免疫组织化学法检测食管鳞状细胞癌组织中的CAFs的浸润情况并计算微淋巴管密度(microlymphatic vessel density,MLVD)，探讨食管鳞状细胞癌中CAFs与淋巴转移及淋巴管生成的关系。

1 材料和方法

1.1 实验材料本研究样本取自河南科技大学第二附属医院2012年5月至2015年5月手术切除并病理确诊的食管鳞状细胞癌的新鲜组织。选取新鲜无坏死食管鳞状细胞癌组织53例，正常食管黏膜组织25例(取材距癌灶>5 cm)。患者入选标准：①病理类型确诊为食管鳞状细胞癌；②手术前未经放疗化疗及其他治疗；③病历资料完整可靠。临床分期根据2017年第八版UICC/AJCC食管癌的TNM分期标准进行评定[5]。D2-40抗体试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔anti-α-SMA单克隆抗体购自美国Abcam公司，兔Streptavidin-HRP试剂盒购自康为世纪，小鼠二步法免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法所有组织样本均于离体2 h内用无菌生理盐水清洗并用4%多聚甲醛固定，进行石蜡包埋、切片(4 μm)、烤片、脱蜡水化、高压修复抗原(α-SMA采用柠檬酸钠缓冲液 pH6.0，D2-40采用EDTA pH 9.0)，严格按照试剂盒说明书进行SP法染色，苏木素复染、脱水透明、中性树胶封片，室温下晾晒24 h。显微镜下观察并采集图像。

1.3 结果判定

1.3.1 CAFs计数α-SMA阳性表达位于细胞质，均呈棕黄色颗粒，阳性细胞即为CAFs。用显微镜于低倍镜(10×10倍)下观察免疫组织化学染色切片，选取阳性表达细胞的密集区，即为“热区(hot spot)”，再于高倍镜(40×10倍)下随机选取5个视野，计数各个视野中表达 α-SMA的细胞数，取平均值即为每高倍镜(high power lens,HP)视野下CAFs数。

1.3.2 MLVD计数D2-40阳性表达位于细胞膜，呈棕黄色颗粒，阳性细胞即为淋巴管内皮细胞。用显微镜于低倍镜(10×10倍)下观察免疫组织化学染色切片，选取新生淋巴管密集的区域，即为“热区”，再于高倍镜(40×10倍)下随机选取5个视野，计数各个视野中微淋巴管的数量，取平均值即为每高倍镜视野下MLVD。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌组织及正常食管黏膜组织中CAFs计数α-SMA作为CAFs的特异性标志物，其阳性表达位于细胞浆，呈棕黄色颗粒，α-SMA的表达情况即可反映CAFs的浸润情况。结果显示：食管鳞状细胞癌组织中CAFs的浸润数量明显多于正常食管黏膜组织(P<0.05)，CAFs在两种不同组织中的浸润情况见表1，在两种不同组织中的染色情况见图1。

表1 CAFs在两种不同组织中的浸润情况

A：正常食管黏膜组织(SP法，×100)；B：食管鳞状细胞癌组织(SP法，×100)。图1 CAFs在两种不同组织中的浸润情况

2.2 食管鳞状细胞癌组织中CAFs的浸润数量与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系食管鳞状细胞癌组织中CAFs的浸润数量明显多于正常食管黏膜组织，因此，本研究进一步探讨在食管鳞状细胞癌组织中CAFs的浸润数量与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系。表2结果显示，CAFs的浸润数量与食管鳞状细胞癌患者的性别、年龄无关(P>0.05)，而与病理分级、浸润深度以及是否发生淋巴结转移有关(P<0.05)。

表2 食管鳞状细胞癌组织中CAFs数量与患者临床病理特征的关系

2.3 食管鳞状细胞癌组织及正常食管黏膜组织中D2-40的表达(MLVD)情况D2-40作为淋巴管内皮细胞的特异性标志物，其阳性表达位于细胞膜，呈棕黄色颗粒，D2-40的表达情况即可反映淋巴管的生成情况，即微淋巴管密度(MLVD)。结果显示：食管鳞状细胞癌组织中MLVD计数明显多于正常食管黏膜组织(P<0.05)，淋巴管在两种不同组织中的生成情况见表3，在两种不同组织中的染色情况见图2。

表3 D2-40在两种不同组织中的表达情况(MLVD)

A：正常食管黏膜组织(SP法，×100)；B：食管鳞状细胞癌组织(SP法，×100)。图2 淋巴管在两种不同组织中的生成情况

2.4 食管鳞状细胞癌组织中CAFs数量与MLVD计数之间的关系食管鳞状细胞癌组织中CAFs的浸润数量与MLVD计数均明显高于正常食管黏膜组织，且对53例食管鳞状细胞癌组织中CAFs的浸润数量与MLVD计数进行Spearman相关性分析显示，r值为0.632(P<0.05)，两项数值呈正相关。

3 讨论

目前食管鳞状细胞癌分子机制的初步研究主要集中在肿瘤细胞的内在特征，即癌基因的激活和抑癌基因的失活。然而，越来越多的证据表明肿瘤细胞的外在因素，即肿瘤微环境，也是肿瘤发生、发展的重要组成部分[6-7]。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是肿瘤存在的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎性细胞、淋巴细胞、信号分子和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)[8]。肿瘤与周围微环境密切相关，相互作用不断。肿瘤可以通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响微环境，而微环境中的各类间质细胞和生物活性物质可以影响肿瘤细胞的生长。CAFs是肿瘤微环境中肿瘤基质的主要组成部分，其不仅作为结构骨架为肿瘤细胞提供机械支持，更可以通过旁分泌途径、外泌体途径、免疫应答调节途径以及细胞外基质重塑等方式促进肿瘤的发生、发展[9]。本研究中，通过对CAFs的标记蛋白α-SMA进行免疫组织化学染色，了解其在组织中的浸润情况，经统计分析表明CAFs在食管癌鳞状细胞癌组织中的浸润数量明显多于正常食管黏膜组织。将CAFs在食管癌鳞状细胞癌组织中的浸润情况与患者的临床病理资料进行统计分析发现，食管鳞状细胞癌组织中CAFs的浸润数量与临床分期、浸润深度、肿瘤淋巴结转移密切相关。本研究与文献报道相似，推测CAFs在食管鳞状细胞浸润和淋巴转移中发挥重要作用。

有大量证据表明，CAFs在肿瘤的发生、发展和最终扩散中起着重要作用，CAFs能够通过分泌多种生长因子、趋化因子、基质金属蛋白酶等细胞外基质成分参与肿瘤的发生、生长、增殖以及转移等过程。有研究发现，CAFs能够分泌转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)，TGF-β信号通路在调节肿瘤发生中起着双重作用，即在肿瘤早期阶段抑制其生长，但后来则促进上皮—间质转化及肿瘤转移[10]。在对食管鳞状细胞癌的器官型培养模型的研究中发现，CAFs分泌的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对于肿瘤细胞侵袭是必需的，且应用siRNA和药物抑制HGF/c-Met信号通路可以有效地阻止肿瘤细胞的侵袭[11]。在缺氧等环境条件的影响下，肿瘤和基质细胞，特别是CAFs，能够分泌活化的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，有研究显示食管癌中存在VEGF-A的高表达，且一些研究表明在食管鳞状细胞癌中VEGF-A的表达与患者预后相关[12]。本研究通过对淋巴管内皮细胞的标记蛋白D2-40进行免疫组织化学染色并对组织进行MLVD计数，经统计分析表明MLVD在食管癌鳞状细胞癌组织中明显高于正常食管黏膜组织，说明在食管鳞状细胞癌组织中淋巴内皮的增殖明显。对食管鳞状细胞癌组织中CAFs的浸润数量与MLVD进行相关性分析发现，两者呈正相关。由此推测，CAFs能够促进淋巴管生成，进而参与食管鳞状细胞癌的浸润和转移。

目前食管癌的标准疗法仍局限于手术或内镜切除以及放化疗，但食管癌的预后仍然很差，5 a生存率约为15%～25%[13]，这主要是由于未能及时诊断或判断转移倾向。本研究结果表明，CAFs与食管鳞状细胞癌的浸润和转移等生物学行为关系密切且可能发挥重要作用，进一步探索CAFs在其中作用的具体机制，对于食管鳞状细胞癌的早期预防和靶向治疗具有重要意义。