液相色谱技术在特种乳制品中掺入其他乳源的研究现状

文/谢婷婷 黄子珍 曾庆坤 杨 攀 李 玲 黄 丽＊

（1 中国农业科学院广西水牛研究所；2 广西壮族自治区水牛乳质量与安全控制技术工程研究中心；3 广西南宁市武鸣区市场检验检测服务中心）

我国乳制品种类丰富，除了市面上常见的普通牛乳（包括荷斯坦牛乳、娟珊牛乳等），还有水牛乳、羊乳、驴乳、牦牛乳、马乳、驼乳等特种乳。特种乳因为特种乳畜的养殖规模较小，产量相对稀少，但又具有独特的活性成分和功能性特异蛋白，能够增强人体免疫力和抵抗疾病能力，因此，价格较普通牛乳高出数倍，通常作为高端产品流通于市场。但特种乳与普通牛乳在外观和味道上无明显差别，普通消费者无法分辨，导致不法商贩为了牟取暴利将不同种类乳混合掺假，尤其是发展较好的水牛乳、羊乳和驼乳，常见在其液态乳、奶酪、奶粉中掺入普通牛乳，再以高价卖出，严重损害了消费者的合法权益，扰乱了特种乳的市场。为了应对这一现象，采取严厉措施以及利用检测技术来防范此类掺假行为是非常必要且有意义的。目前，对于不同种类乳混合掺假的鉴别，一般根据乳制品中所含组分，如蛋白质、脂肪、维生素和遗传基因等的差异来建立检测方法，其中以色谱技术为基础的高效液相方法显示出很多的优势，其具有分离速度快、分辨率、精确度和灵敏度高，重复性好，易于操作等优点，在过去的几年里，已成功地应用到了乳制品的定量检测和掺假鉴别领域。本文综述该技术在不同种类乳中掺假检测的研究现状。

1 液相色谱技术

液相色谱技术又称高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），是一种快速、高效的检测方法，其分离度和分辨率较高，能同时进行定量和定性分析[1]。HPLC包括高压输注系统、样品引入系统、色谱分离系统和检测器，能够利用梯度控制器使得固定相与流动相多次交换，实现样液中混合物的分离。主要检测过程为将待测液输送到样品引入检测装置，使用高压泵将流动相输入柱中，样器内液体逐渐流动进入色谱柱，实现待测物的分离，分离后组分依次进入检测器，再通过检测器发送信号获取相关数据信息，实现检测[2]。HPLC主要是依据不同种类乳的蛋白质分子构成和维生素结构不同实现掺假检测，常用的色谱包括反相色谱（RPC）、离子交换色谱（IEC）、体积排阻色谱（SEC）和疏水相互作用色谱（HIC）。这几种色谱对复杂样品的分离能力存在差别，其中RPC最佳，IEC和HIC次之，SEC较前三者差。因此，RPC在乳蛋白质的分析研究中，较其他色谱法具有更高的分离能力，应用更广泛[3]。

反相高效液相色谱（R e-versed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RPHPLC）是利用蛋白质的疏水特性差异进行分离。其固定相通常是将机械强度好的多孔微粒硅胶与含羟基链或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面有烷基或苯基的非极性固定相，流动相为比固定相极性更强的溶剂[4]。蛋白质在固定相四围形成高度有序的水相结构，在疏水作用下，蛋白质暴露于溶液的疏水表面逐渐变少，降低水相有序性而增加体系的熵，随后，通过改变流动相的组分使得结合的蛋白质按照疏水性强弱逐渐洗脱到流动相中[5]。RP-HPLC已广泛应用于蛋白质的分析，近年来在乳蛋白质的分离和纯化方面起到了重要作用，也为特种乳掺假检测提供了可靠支持。

表1 不同种类乳成分和能量[7]

2 不同种类乳的成分差异

不同种类乳成分和能量存在一定的差别（表1）。与普通牛乳相比，水牛乳、牦牛乳和绵羊乳的蛋白质和脂肪含量较高，乳糖含量较低，乳品质更佳。除此之外，特种乳中还具有独特的活性成分，如羊乳富含短链脂肪酸，酪蛋白与乳清蛋白的比值更接近于人乳；马乳的维生素C和牛磺酸的含量都高于普通牛乳；驴乳中的硒和维生素含量分别是普通牛乳的8 倍和5 倍；驼乳的不饱和脂肪酸和矿物质（镁和钙）含量也优于普通牛乳[6]。这些优势使得特种乳在提高免疫力、抵抗疾病等功效方面优于普通牛乳。而液相色谱技术可以基于特种乳特异成分上的差异，识别乳制品中的掺假现象。

3 基于不同种类乳酪蛋白差异性掺假检测

乳蛋白作为乳制品重要的营养指标，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，酪蛋白含量约为蛋白质总量的80.00%，主要以αs1-酪蛋白（αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）和κ-酪蛋白（κ-CN）为主，目前研究以酪蛋白为标记成分，借助液相色谱技术，获得不错的鉴伪效果，且以RP-HPLC应用较多。在不同种类乳中，由于品种和个体之间的差异，核酸序列中特殊基因的突变导致氨基酸序列的不同乳蛋白表现出基因多态性，可作为掺假的依据[8]。梁政洋等[9]根据水牛乳与荷斯坦牛乳存在的蛋白多态性差异，将在RP-HPLC中分离特征酪蛋白的峰面积作为评价指标，以αs1-CN指纹图谱特征峰作为掺假标记，当荷斯坦牛乳掺入量至2.00%时可被检测到，实现快速准确地分析水牛乳中掺入荷斯坦牛乳的情况。Veloso等[10]采用RP-HPLC分离从普通牛乳、绵羊乳和山羊乳混合乳制品中纯化的酪蛋白，均可以从色谱图显著评价掺假情况，并且山羊乳中掺入普通牛乳的检测下限可以达到5.00%，检测结果与尿素-聚丙烯酰胺电泳（Urea-PAGE）一致，但定量分析更准确。Mayer等[11]利用IE-HPLC法分离普通牛乳、绵羊乳和山羊乳中的酪蛋白，根据样品中αs1-酪蛋白和para-κ-酪蛋白峰面积的差异，可以鉴别掺假液态乳和奶酪。现代分析中，更多的强调多种分析技术的联合应用，比如液相色谱-质谱联用，液相的高分离效果结合质谱的高特异性和灵敏性，尤其是对蛋白质和肽的结构信息解析上的优越性，使得其在掺假乳制品检测中具有较好的适用性。姜敏[12]采用液相色谱/线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q Exactive）检测4 种羊乳粉和5 种全脂乳粉中的特异肽段进行初步辨别是否掺假，再建立高低含量普通牛乳的标准曲线对已知掺假比例的牛羊乳粉混合物进行了定量检测，方法相对标准偏差RSD值小于15.00%，实验结果可靠，灵敏度高，可用于牛羊乳掺假的筛查和定量检测。除了检测方法的结合外，借助数据分析手段如指纹图谱和化学计量法能够进一步提高检测的实用性和准确性。马露[7]使用RP-HPLC分离和量化了奶牛、山羊、水牛及牦牛乳蛋白组分，并获得特征图谱，且通过主成分分析法（PCA）可较为明显的区分不同种类乳。雷颖颖等[13]利用RP-HPLC获得羊乳蛋白质的色谱信息，结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统和主成分分析法，研究山羊乳和绵羊乳的差异性，结果表明，以蛋白质作为特征性成分能够反映出羊乳的乳源品类和质量信息，实现对乳源品质的鉴别。

4 基于不同种类乳中乳清蛋白差异性掺假检测

乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-LG）、血清白蛋白（BSA）、乳铁蛋白、免疫球蛋白和溶菌酶[10]。不同种类乳中乳清蛋白遗传多态性不同，因此，在液相色谱仪中出峰时间有区别，能够定性定量检测不同种类乳的掺假情况，作为乳制品中是否掺假的特征蛋白而受到较多关注。Rodriguez等[14]运用HPLC分离奶牛乳、山羊乳和绵羊乳混合样的液态乳及奶酪中乳清蛋白，结合主成分分析法定性检测和偏最小二乘（PLS）校正模型确定掺假比例，绵羊乳、山羊乳和奶牛乳的检出下限为3.92%、2.81%和1.47%，能够高效、灵敏、可靠测定不同乳源。在多种乳清蛋白同时作为标记物的研究中，成希飞等[15]利用RP-HPLC分析了水牛乳与荷斯坦牛乳2 种主要乳清蛋白的差异性，发现在保留时间、含量和遗传变异上都有显著的差异性，两者乳清蛋白α-LA均无变异体，但水牛乳的β-LG有3 个变异体，而荷斯坦牛乳的β-LG有2 个变异体。分析是由于两种乳源在蛋白质的一级结构上有所不同，从而造成蛋白在高级结构、分子量、所带电荷及蛋白极性等方面不同，在进行梯度洗脱时，蛋白质随洗脱液的疏水性的改变而逐步被洗脱，从而出峰时间有差异。Romero等[16]采用RP-HPLC分离普通奶牛乳、绵羊乳和山羊乳及其二元混合物的主要乳清蛋白BSA、α-LA和β-LG，通过保留时间差异能够定性区分3 种乳源的乳清蛋白，同时发现奶牛乳的添加比例与其α-LA及β-LG峰面积之和成线性关系，能够定量检测羊乳中奶牛乳的掺假量，检出限为1.00%，但无法定量识别绵羊乳中掺入山羊乳的情况。也有学者以单一乳清蛋白为标记物构建掺假检测方法。Christoph等[17]以乳清中的β-LG为标记物，基于普通牛乳中的两种β-LG蛋白（A和B）以及水牛乳的β-LG在氨基酸序列上的差异，采用液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用的方法检测水牛乳和奶酪中普通牛乳成分，从色谱分离和质谱分析两个水平检测出了混合乳中的不同来源β-LG的差异，有效的避免了假阴性问题。Chen等[18]以β-LG为分子标记，采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术（HPLC/ESI-MS）分离羊乳中奶牛乳掺假的乳清蛋白，从色谱图上β-LG的保留时间和质谱的总离子流图谱来鉴定掺杂物，通过外标法测定掺假量，检出限为50.00%。Ferreira等[19]认为β-LG在奶酪成熟过程中不发生降解，可作为不同种类乳源的掺假标记物，研究了RP-HPLC分离普通牛乳、山羊乳、绵羊乳及其二元混合液态乳和奶酪中的β-LG，通过β-LG遗传多态性色谱图定性识别掺假，并认为二元掺假中掺加量与β-LG峰面积的比值成线性关系，能够定量混合液态乳、新鲜奶酪和成熟奶酪中不同种类乳源成分的比例，以及评价乳制品的真实性，尤其可以保护原产地标记（PDO）奶酪。以β-LGA与β-LGB峰面积比值作为检测定量掺假程度的研究也不少。杜晞等[20]利用RP-HPLC对水牛乳中掺入奶牛乳的混合样乳清蛋白进行分离，发现β-LG与其他蛋白组分在30 min 内均获得较好的分离，以β-LGA和β-LGB的峰面积比值确定检出限为10.00%，灵敏度不如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）的检出限1.00%，但分离得到峰较少、检测时短，重复性较好。但β-LG在乳源的加工过程中发生降解，从而导致二者比例的变化，引起测定结果不准确。Giuseppe等[21]采用RP-HPLC对水牛乳中掺入奶牛乳的鲜乳、马苏里拉奶酪和高温灭菌乳的乳清蛋白进行分离，发现奶牛乳β-LG有A和B两种基因型，水牛乳只有B基因型，可以从色谱图上直观判断掺假情况，同时，以β-LGA和β-LGB的峰面积比值与掺假量建立回归关系，经回归分析后可矫正因加工过程中所引起的试验偏差，检出限为0.50%。

5 基于不同种类乳维生素差异性掺假检测

部分动物（如水牛和羊）体内的β-胡萝卜素在转化酶作用下分解为维生素A，因此，其分泌的乳汁中β-胡萝卜素含量极少或没有，感官上呈纯白色，而奶牛体内缺乏这种酶，分泌的乳汁中含有较高含量β-胡萝卜素而呈浅黄色，可作为差异评判的特征性指标。国内学者李宝宝等[22]以β-胡萝卜素的含量作为特征指标，采用HPLC追踪测定泌乳期4—9月期纯普通牛乳、纯羊乳以及普通牛乳添加量0～100.00%的掺假乳中β-胡萝卜素含量波动范围，以此为数据库构建检测方法，该方法对β-胡萝卜素的检测限为0.31×10-2μg/mL，定量限为1.00×10-2μg/mL，能够实现定量判定分析，且简单快速，成本较低，适宜于乳品企业或收奶站在收奶时快速检测。

6 小结

在欧洲许多国家通过法律来规定生产者需标注乳制品的乳源信息，而目前我国国家层面对特种乳制品的区别检测未有统一标准，导致市场上特种乳制品品质良莠不齐，打着特种乳的招牌虚假宣传的行为屡见不鲜，阻碍了我国特种乳制品的发展。为保护好优质特种乳制品的良好声誉，打击假冒伪劣不良行为，亟待建立相应掺假检测标准方法。液相色谱技术分析乳制品特征组分上具有分析速度快，分离效果好，灵敏度高，检测限低，高度自动化，准确性高等优势，可进一步探索构建特种乳乳源的定性定量检测方法，对乳制品的质量监测提供检测保障。