新疆石河子地区某规模奶牛场奶牛乳房炎链球菌的分离鉴定及药敏试验

文/马 博 卜三平 刘 鸽

（1 新疆巴音郭楞职业技术学院；2 新疆维吾尔自治区畜牧总站）

奶牛乳房炎（Mastitis）也称乳腺炎，是泌乳奶牛乳腺细胞受到物理、化学和病原微生物的共同作用而形成的一种炎症反应，其中病原微生物感染是最主要的致病因素[1～5]。奶牛乳房炎在各奶牛场中普遍存在，是制约奶牛场经济效益的疾病之一，也是影响乳制品质量的重要因素。根据奶牛乳房有无红、肿、热、痛等临床症状，将奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎。导致奶牛乳房炎的致病菌有150 余种，其中常见的有20 多种，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌三大致病菌为主，其中链球菌是革兰氏阳性菌，引起奶牛乳房炎的链球菌主要有无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌等[6～9]。检测奶牛乳房炎常用的方法有乳样体细胞检测法、兰州隐性乳房炎检测试剂法、乳样酸度检测法、乳样电导率检测法，其中前两种方法在实际生产中应用最为广泛。

目前，治疗奶牛乳房炎仍以使用抗生素为主，但长期使用抗生素容易使致病菌产生耐药性，所以选择敏感药物尤为重要。结合奶牛场的实际情况也有使用抗菌肽、噬菌体、中药等进行治疗的案例。本试验主要针对新疆石河子地区某规模奶牛场进行了乳房炎链球菌流行病学调查和分离，对分离到的菌株进行药敏试验，旨在为新疆石河子地区奶牛场乳房炎的防治工作提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

在新疆石河子地区的某规模奶牛场进行乳房炎流行病学调查，发现部分临床型乳房炎奶牛和隐性乳房炎奶牛。选择12 头临床型乳房炎奶牛的20 个乳区乳样和12 头隐性乳房炎奶牛的16 个乳区乳样进行细菌分离与鉴定。

1.1.2 主要仪器设备

净化工作台（上海鸿都电子科技有限公司）、4 ℃保鲜冰箱（山东青岛海尔集团）、控温冰箱（日本三洋冰箱设备）、电热套（KDM型，江苏南通设备厂）、培养皿、涂布器、恒温箱（常设置成37 ℃恒温）、电子称（上海精密科学仪器厂）、磁力加热搅拌器（78-1型，江苏荣华仪器设备场）、高压锅、游标卡尺、接种环、酒精灯、镊子、显微镜等。PCR仪（TC-512）、高倍显微镜、移液枪、水浴锅（XMTD-8222）、超速离心机（GS-21R）、高速冷冻离心机（Multifuge X1R）、微波炉、凝胶成像仪（Bio-Rad）、电泳槽（Power Wave XS2）、电泳仪（DYY-6B）。

1.1.3 主要试剂

琼脂糖、革兰氏快速染色液、TaqDNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker（购自TaKaRa有限公司，大连）、细菌基因组DNA提取试剂盒（引物由北京睿博兴科生物技术有限公司完成）、多种药敏纸片。

链球菌选择性培养基、兔鲜血培养基（兔血含量10 mL/L）、普通营养琼脂培养基、LB液体培养基、LB固体培养基、邓亨氏水、麦芽糖培养基、葡萄糖培养基、蔗糖培养基、乳糖培养基、甘露醇发酵试验、七叶苷水解试验、过氧化氢酶试验生化鉴定培养基等按照实验室常规配置[10]。

1.2 方法

1.2.1 链球菌的富集、分离和纯化

将36 份乳样进行待分离细菌的富集，用接种环蘸取乳样到普通营养肉汤培养基中，置于37 ℃条件下震荡培养24 h左右。将在肉汤培养基中培养好的菌在链球菌选择性平板培养基上划线接种，置于恒温箱中，在37 ℃条件下恒温培养12～24 h。等细菌在链球菌选择性平板培养基上生长良好后，及时挑取单个典型菌落，并在兔鲜血培养基上划线接种培养，置于37 ℃的恒温箱中培养12～24 h，进行涂片，革兰氏染色，镜检，使用显微镜仔细观察染色后玻片上菌体的染色特性和形态。最终，将得到的菌落在链球菌液体培养基上接种，以达到增殖培养的目的[11]。

1.2.2 链球菌的生化鉴定

对培养的链球菌进行分离、纯化、培养后，进行生化鉴定，分别进行蔗糖试验、麦芽糖试验、乳糖试验、过氧化氢酶试验、甘露醇发酵试验、七叶苷水解试验，仔细观察每个试验的结果，并做好相关的记录。

1.2.3 分离菌株的16S rRNA鉴定

参考16S rRNA基因测序法，完成16s rDNA PCR扩增。上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACCACTT-3’（北京睿博兴科生物技术有限公司合成）。按照细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）操作步骤提取链球菌菌株的基因组DNA。

用基因组DNA为模板扩增16S rRNA基因，PCR法采用25 μL反应体系：ddH2O 8.5 μL，PCR Mix 12.5μL，模板2 μL，上、下游引物均1.0 μL；反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，30 个循环；72 ℃延伸7 min。观察目的条带的电泳图像。

1.2.4 耐药性敏感试验

在普通营养琼脂培养基上加50 μL已经培养好的菌液，用“L”棒涂匀，菌液干燥后，在平板上贴5 片不同的药敏纸片（要分布均匀，以免影响试验），纸片的制作标准参照NCCLS（美国国家临床试验室标准化委员会）；试验方法参考《兽医微生物学》[12]，放置温箱培养20 h左右，测抑菌环直径，根据抑菌圈的大小来判断该株菌对抗生素的敏感性[13]。

2 试验结果

2.1 链球菌菌株的分离与鉴定

在37 ℃的环境中培养19 h左右，分离到的菌株在普通平板培养基上生长贫瘠；在兔鲜血琼脂培养基上生长良好，形态特征为圆形、表面光滑、隆起、湿润、溶血性、菌落周边成半透明边缘的露滴状，直径大小为1.0～2.0 mm的菌落（图1）；在链球菌选择性平板培养基上接种后形成形态特征为圆形、表面光滑、大小如针尖状的菌落；把分离到的细菌进行涂片、革兰氏染色、镜检，观察记录试验结果，可见紫色、革兰氏阳性、成链状（有短链、长链和双链）排列（图2）；将菌液在4 ℃保鲜冰箱中放置较长时间后，试管底部会有不同程度的沉淀，而选择性液体培养基的上部澄清，并无菌膜形成。

图1 血平板生长情况

图2 显微镜观察情况

2.2 生化鉴定结果

在七叶苷水解试验中，10 株为阴性，2 株为阳性；分离菌在进行蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇发酵等的试验中，均为阳性。按照《柏杰明细菌鉴定手册》的相关知识，将分离到的菌株与之对照，对分离细菌的生化鉴定结果符合有关链球菌的生化鉴定，试验结果判定12 株分离菌均为链球菌。

2.3 分离株的16S rRNA扩增

对12 株奶牛乳房炎链球菌分离株引物扩增16S rRNA基因后，分离菌株均得到了大小为1 550 bp的目的片段（图3）。

图3 12株链球菌16S rRNA PCR扩增

2.4 耐药性试验结果

根据药敏试验发现，从新疆石河子地区某规模奶牛场得到的12 株链球菌对各抗生素的敏感性差异很大，从0.00%到100.00%不等；对头孢唑啉、链霉素、氨苄西林、氧氟沙星、环丙沙星、四环素的敏感率均高于55.00%，对链霉素的敏感率则高达100.00%，而对头孢唑啉、氨苄西林的敏感率分别为83.00%和92.00%；而分离菌株对青霉素、克林霉素、万古霉素、强力霉素四种药物都有较好的耐药性；分离的12株链球菌中多数对庆大霉素、红霉素表现为既不耐受也不敏感（表1）。

3 讨论与分析

3.1 链球菌在奶牛场普遍存在，对某些抗生素的敏感性差异很大

目前，链球菌属共有30 多种，比较常见的有10 多种，其中无乳链球菌为奶牛乳房炎最常见的致病菌[14～19]。链球菌可致人或动物的各种化脓性疾病、肺炎、乳腺炎、败血症等。链球菌在自然界中广泛存在，在人和动物的排泄物中较为常见[20]。链球菌的分离也是实验室比较常规的试验技术，分离过程中应严格按照试验步骤进行。本试验从36 份乳房炎乳样中分离到12 株链球菌，分离率高达33.33%（12/36），且12 株链球菌对各抗菌药的敏感性差异很大，对头孢唑啉、链霉素、氨苄西林、氧氟沙星、环丙沙星、四环素高度敏感，对庆大霉素、红霉素中度敏感，对青霉素、克林霉素、万古霉素、强力霉素明显耐药；分离得到的12 株链球菌对链霉素的敏感率则高达100.00%，而对头孢唑啉、氨苄西林的敏感率分别为83.00%和92.00%。

表1 12 种抗生素对12 株链球菌耐药性试验结果

3.2 本试验分离的链球菌对抗生素的耐药性与其他地区的试验结果相似，同一种细菌的耐药性与地域有的一定关系

2018年王帅等人对黑龙江、上海、河北、山东、内蒙古的部分牧场共计497 份乳房炎患牛的乳样进行无乳链球菌分离鉴定及药物敏感性分析，共分离出无乳链球菌18 株，其中内蒙古地区乳样分离菌株对11 种抗菌药物耐药，黑龙江地区乳样分离菌株对7种抗菌药物耐药[21]，耐药性与本试验结果相似。耐药性的规律与薛梅等人在2015年的研究结果相似，对青霉素均是高度耐药[22]。同一种细菌的耐药性与地域有的一定关系，因为不同地域可能使用同一种抗生素的频率不同，导致耐药菌株出现的概率或者选择强度不同。

3.3 应做好链球菌性奶牛乳房炎的治疗及预防

从链球菌分离情况看，该规模化奶牛养殖场的奶牛乳房炎的致病菌中存在链球菌。致奶牛乳房炎链球菌是环境性致病菌，可在奶牛圈舍中大量生存，因此，做好奶牛圈舍的环境化学消毒工作，切断传播途径尤为重要。奶牛乳头或乳房在挤奶厅因物理因素受伤是一种较为常见的现象，因此，要加强对挤奶厅工作人员挤奶规范操作的培训，并保证挤奶环境清洁，防止环境中菌群增殖。

在使用抗生素治疗由链球菌引起的奶牛乳房炎时，要特别注意选择用药，并严格遵守用药规范[14]。由于细菌对抗生素易产生耐药性，在临床治疗过程中应科学选择多种比较敏感的药物，联合或交替使用，以减少单个药物的使用剂量或使用时间，可减缓耐药菌株的产生，降低乳汁中的药物残留[23～26]。

使用无抗生素成分的药物治疗奶牛乳房炎是一种比较安全、绿色的方案，应根据奶牛场的实际情况进行选择[27～29]。在实际生产中发现奶牛乳房炎以多种致病菌混合感染为主，而快速诊断是诊断奶牛乳房炎的重要研究方向，但目前停留在实验室阶段的较多，奶牛场实际生产中急需更为准确、快速的可现场同时诊断多种致病菌的技术[30，31]。链球菌性乳房炎对奶牛的乳房危害很大，严重影响奶牛乳房乳腺细胞的泌乳功能，应做好充分有效的预防工作，避免链球菌在奶牛群中的感染，使用生物疫苗进行预防免疫是预防奶牛乳房炎的重要且有效的手段，受到了奶牛场的普遍欢迎。C