毛细管区带电泳测定液态奶及奶粉中的A2 β-酪蛋白及总β-酪蛋白

冯 慿,丁晓静,高 铁,杜茹芸,陈泓序*

(1. SCIEX中国, 北京 100015; 2. 惠氏营养品(中国)有限公司, 上海 200041;3. 北京市疾病预防控制中心, 北京 100013; 4. 上海市质量监督检验技术研究院, 上海 200233)

牛乳是重要的营养物质,它不仅是婴幼儿获取蛋白质的重要来源之一,也为成年人提供高质量的蛋白质。牛乳中的蛋白主要分为两种,酪蛋白(CN)和乳清蛋白。其中约80%为CN, 20%为乳清蛋白[1]。牛乳中的CN主要由αS1-CN、αS2-CN、β-CN和k-CN这4种亚型组成,其中β-CN约占CN的33%～40%[1-3]。迄今为止已发现世界上的奶牛可以含有13种不同的β-CN变异体[4]: A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、G、H1、H2和I。其中A1、A2、B、C和I是比较常见的5种变异体,其他变异体极为少见[4-6]。A1和A2出现的概率最高,C和I出现的概率很低。根据67位氨基酸是否发生突变,把这些β-CN变异体分为A1型β-CN和A2型β-CN两类。如果蛋白的氨基酸序列中第67位氨基酸由原始的脯氨酸突变为组氨酸(如A1、B和C等变异体),则归类为A1型β-CN;若67位氨基酸未发生突变,仍为原始或野生型(如A2和I等变异体),则归类为A2型β-CN。有研究表明[5,7-10],经过人体消化酶酶解后,含突变氨基酸的A1型β-CN会产生能被人体直接吸收并引起某些非传染性疾病(如孤独症、精神分裂症、I型糖尿病、冠心病等)的β-酪啡肽(BCM-7),或造成肠胃不适;而原始型A2型β-CN则不会产生BCM-7。全球有约30%奶牛只产A2β-CN[11],所谓A2乳制品是指由这些只产A2β-CN,或以产A2β-CN为主的奶牛产出的奶加工而成的乳制品。β-CN变异体引起的营养和病理的讨论,至今仍是争议很大的议题。即使如此,从亚洲到美洲和欧洲,市场上都出现了有关A2β-CN的奶制品及其功能声称,而且价格都明显高于非A2β-CN的奶制品。目前,市面上的A2β-CN的奶制品也仅是声称A2β-CN“为主”,至于A2β-CN成分的含量并没有明确的规定,这给各国政府法规制定带来了很大的挑战。为评价A2乳制品的真实质量,以保护消费者的利益,建立乳制品中A2β-CN定量分析的方法非常必要。

目前有关乳制品中A2β-CN分析的方法有免疫学方法[11]、平板凝胶电泳法[12]、液相色谱法[2,13]、液相色谱-质谱法[14]、整蛋白液相色谱-高分辨质谱法(LC-HRMS)[3,15]和毛细管电泳法(CE)[16-19]。免疫学和平板凝胶电泳方法难于精确定量;而液相色谱法无法对发生了美拉德反应(高温消毒或热喷粉过程中,蛋白与乳糖发生的糖化反应)的蛋白进行分离,因此只适合巴氏杀菌的液态奶(简称巴氏奶)中A2β-CN的分离;液相色谱-质谱法是基于蛋白组学的原理,使用胰蛋白酶酶解CN,通过质谱检测酶解产生的特异性肽段,来对乳制品中A1和A2β-CN进行鉴定和定量的方法,但由于美拉德反应发生在赖氨酸上,而胰蛋白酶作用位点也是赖氨酸,这使该方法仅局限于对未生成美拉德反应产物的乳制品中的A1和A2β-CN的定量测定[14];整蛋白液相色谱-高分辨质谱法对仪器、分析软件和人员的要求很高,目前只有一篇文章报道了该方法对乳制品中β-CN各变异体的定量测定[15];利用CE分析A2β-CN的已有报道中,大部分仅进行了CN的分离[16,17]或A1和A2β-CN的定性分析[18],未对A2β-CN进行含量的测定。仅有的使用CE方法对A1和A2β-CN进行定量测定的报道也仅局限于对未生成美拉德反应产物的乳制品中的A2β-CN的定量测定[19]。

本文建立了对液态奶和奶粉中A2β-CN和总β-CN进行分离并定量的毛细管区带电泳(CZE)方法。该方法不仅可以分析巴氏奶产品,而且对发生了美拉德反应的超高温杀菌(UHT)奶及奶粉中的A2β-CN和总β-CN,也可以进行有效地分离和定量分析。方法操作简单,快速,具有良好的精密度和准确度。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

SCIEX PA 800 Plus药物分析系统(毛细管电泳仪,配备紫外检测器)和 32 KaratTM软件10.1(SCIEX,美国); Vortex-Genie 2涡旋混合器(Scientific Industries,美国);超声波振荡仪(5510 Branson, Fisher Scientific,美国); Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色谱和Agilent 6545XT Q-TOF质谱仪(Agilent,美国)。

尿素(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;一水合磷酸二氢钠(纯度≥98%)、二水合磷酸氢二钠(纯度≥98%)、柠檬酸(纯度≥99.5%)、磷酸(85%(质量分数)水溶液)购自德国Merck公司。羟丙基甲基纤维素(HPMC,分析纯,货号:09963)、羟乙基纤维素(分析纯,相对分子质量90 000,黏度75～100 cP)、2-羟乙基纤维素(分析纯,相对分子质量250 000,黏度80～125 mP)以及α-CN(纯度≥70%)、β-CN (纯度≥98% (PAGE))、κ-CN(纯度≥70%)、α-乳白蛋白(α-lactalbumin, 纯度≥85%(PAGE))、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, 纯度≥90%(PAGE))、牛血清蛋白(bovine serum albumin,纯度≥98%)、免疫球蛋白G (immunoglobulin G,纯度≥95%)、乳铁蛋白(lactoferrin,纯度≥85%(PAGE))均购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 标准储备液的配制

称取70 mgβ-CN,置于5 mL容量瓶中,加入适量超纯水超声溶解(勿涡旋,防止太多泡沫产生),用超纯水定容,混匀。根据β-CN的蛋白纯度计算该储备液质量浓度为12 g/L。分装0.5 mL于1.5 mL的安全锁定微量离心管中,储藏于-20 ℃,可稳定至3个月(避免反复冷冻融化)。

1.3 分离缓冲溶液和样品稀释液的配制

以水作溶剂,分别配制10 mol/L尿素、0.2 mol/L Na2HPO4、1.0 mol/L柠檬酸和1% (质量分数) HPMC作为储备液。

分别移取10 mL尿素、6.25 mL Na2HPO4、3.5 mL柠檬酸和5 mL HPMC储备液,均置于同一25 mL容量瓶中,用超纯水稀释、定容至刻度,混匀配制成50 mmol/L Na2HPO4+140 mmol/L柠檬酸+0.2% HPMC+4 mol/L尿素的分离缓冲溶液(pH为2.7)。

分别移取5 mL Na2HPO4、2 mL柠檬酸和12.5 mL尿素储备液,均置于同一25 mL容量瓶中,用超纯水稀释、定容至刻度,混匀则配制成40 mmol/L Na2HPO4+80 mmol/L柠檬酸+5 mol/L尿素的样品稀释液(pH为2.7)。

1.4 实验样品及前处理

A2巴氏奶和普通(A1/A2)巴氏奶样品分别购自上海和苏州超市。A2全脂奶粉购于上海超市。普通(A1/A2)脱脂奶粉是用于生产婴儿奶粉的脱脂奶粉原料。A2全脂奶粉和普通脱脂奶粉均经喷粉干燥制得。A1脱脂奶粉是用不含A2变异体的牛奶在爱尔兰小规模生产制得。

对于奶粉样品,配制相当于约10 g/L蛋白含量的样品水溶液,涡旋混合均匀,再与样品稀释液以等体积比混匀。对于液态奶样品,根据样品中蛋白含量,先用水稀释一倍或两倍,再与样品稀释液以等体积比混匀。

1.5 毛细管电泳条件

毛细管的活化:0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl、去离子水和分离缓冲液依次在138 kPa下冲洗30、2、2和10 min。每两针运行间毛细管的冲洗:使用上述溶液在138 kPa下依次冲洗2、1、2和3 min。

熔融石英毛细管,50 μm×30/40 cm (有效/总长度)(SCIEX,美国);样品温度:25 ℃;毛细管温度:38 ℃;窗口狭缝:2 (100 μm×200 μm);分离电压:20 kV (500 V/cm);进样压力及进样时间:3.5 kPa, 10 s;检测器及波长:UV 214 nm。

1.6 液相色谱-质谱条件

液相色谱条件 色谱柱:Advance Bio RP-mAb C4柱,3.0 mm×150 mm, 45 nm, 3.5 μm;流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液;流动相B为80%(v/v,下同)异丙醇+10%ACN+9.9%水+0.1%甲酸;流速:0.6 mL/min;柱温:80 ℃。

Q-TOF质谱条件 离子化模式:AJS ESI,正离子模式;干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:12 L/min;雾化气:414 kPa;鞘气温度:400 ℃;鞘气流速:11 L/min;毛细管电压:5 500 V;喷嘴电压:1 200 V;碎裂电压:380 V;扫描模式:1 scan/s。

1.7 总β-CN和A2 β-CN的积分和浓度计算

总β-CN的校准峰面积由β-CN各变异体的校准峰面积加和得到。总β-CN标准溶液的浓度可以由β-CN标准品准确配制。A2β-CN的浓度由A2β-CN和总β-CN的校准峰面积比值与总β-CN的浓度计算得到。根据总β-CN和A2β-CN的校准峰面积对其浓度制作相应的线性曲线,通过外标法来计算待测样品中总β-CN和A2β-CN的浓度。对于高温喷粉的奶粉或UHT奶,由于具有美拉德反应产物,β-CN各变异体的校准峰面积是由变异体和其美拉德反应产物峰的校准峰面积加和来计算的。

2 结果与讨论

2.1 分离缓冲液种类、pH和分离温度的选择

本研究初期选用磷酸-磷酸盐体系作为分离缓冲液。虽然α-CN的分离更好,β-CN的迁移时间更短,但对各β-CN的美拉德反应产物的分离差。为了改善各β-CN的分离,尝试向分离缓冲溶液中加入3%的乙腈。结果表明乙腈的加入延长了各蛋白的迁移时间,但不会改善各β-CN之间的分离。而改用磷酸盐-柠檬酸盐体系,则β-CN和其美拉德反应产物获得较好分离,故本研究选用磷酸盐-柠檬酸盐体系为最佳分离缓冲体系。

CN的pI为4.6左右,是富含磷酸根的疏水性蛋白。CN在液体中以胶束状悬浮,并通过所带的磷酸根与钙等阳离子结合。当分离缓冲溶液的pH低于CN的pI,且相差2左右时,CN带正电。另外,CN胶束间的作用力以及磷酸根与钙等阳离子的静电力被酸性条件削弱,有利于β-CN从CN胶束中游离出来进入水溶液中,利于其准确定量。因此,分离缓冲体系选择pH为2.7。

分离温度为25 ℃和38 ℃时均可实现分离,但后者可缩短三分之一的电泳分析时间,故本研究将毛细管温度控制在38 ℃。

2.2 分离缓冲液中添加剂的选择

为进一步改善各峰间的分离,考察了纤维素类添加剂HPMC、羟乙基纤维素和2-羟乙基纤维素的分离效果。当分离缓冲溶液中添加0.2%(质量分数)的羟乙基纤维素时,基线向上漂移,25 min内未见蛋白峰;添加0.2%(质量分数)的2-羟乙基纤维素时,巴氏奶和经高温喷粉的奶粉样品中,β-CN的B、A1和A2变异体均得到理想的分离,但在成分、基质和加工工艺更复杂的婴儿配方奶粉中,β-CN各变异体的分离不好。而使用HPMC作为添加剂时,巴氏奶、普通奶粉和婴儿配方奶粉中的β-CN变异体都可以得到分离,故最终选择HPMC为添加剂。

分离缓冲溶液中加入尿素也可破坏CN胶束间的作用力以及磷酸根与钙等阳离子的静电力,促使β-CN从CN胶束中游离出来,有利于其分离和定量。本研究发现尿素浓度会影响蛋白峰的尖锐程度,5 mol/L尿素会使蛋白峰的迁移时间增加,也会导致蛋白峰峰形展宽。经优化,选择尿素浓度为4 mol/L。

2.3 样品的前处理条件

由于本方法专注于β-CN的分离和定量,而β-CN不含半胱氨酸,不会与其他乳蛋白生成二硫键,所以本方法的样品前处理中无需使用还原剂对样品进行还原,直接用去离子水配制到指定浓度,并与样品稀释液混合即可。

2.4 β-CN标准品中各变异体的分离和鉴定

CN属于疏水性大分子,在水中以胶束方式聚集,悬浮于水中。在本方法中,各β-CN的不同变异体在高浓度尿素和酸性条件下从CN胶束中游离出来,在电场和含HPMC的分离缓冲液中表现出不同的迁移速率。图1是β-CN标准品分离的电泳图。图2是除β-CN外其他牛奶蛋白标准品混合物的电泳图,其中α-CN包含αS1-CN和αS1-CN[17,18](图2中的峰6和7)。比较图1和图2,两张图显示β-CN的出峰时间区段与其他牛奶蛋白不重合。不仅β-CN与其他乳蛋白成功分离,3种主要β-CN变异体之间(B、A1和A2)也得到了基线分离。

图 1 CZE方法分析β-CN标准品的电泳图Fig. 1 Electropherogram of β-CN standard by capillary zone electrophoresis (CZE) CE conditions: background electrolyte (BGE), citric acid and phosphate buffer (50 mmol/L Na2HPO4+140 mmol/L citric acid+0.2% (mass fraction)HPMC+4 mol/L urea); capillary, fused silica capillary (30/40 (effective/total length), 50 μm i.d.); injection, pressure 3.5 kPa, 10 s; voltage, 20 kV; capillary temperature, 38 ℃; sample storage temperature, 25 ℃; detection, UV at 214 nm. Peaks: 1. B β-CN; 2. A1 β-CN; 3. A2 β-CN.

由于各种β-CN变异体的标准品很难获得。我们根据以下两种方法对B、A1和A2变异体进行鉴定。(1)根据各变异体所含氨基酸的带电情况推测理论出峰顺序。5种主要β-CN氨基酸序列差别列于表1。根据各个变异体所包含的碱性氨基酸的分析,在pH 2.7的条件下,各变异体带正电荷由多到少的顺序依次为B=C>A1>A2=I。由于各个变异体的体积基本一致,因此在根据电荷/体积分离的CZE模式下,其迁移顺序主要取决于各个变异体的带电荷情况,其理论出峰顺序应为:B (C接近B)、A1、A2 (I接近A2)。其中变异体B和C、A2和I的迁移会非常接近,难以分离。但C和I变异体的含量较低,因此,推断图1中的峰1、2和3分别为B、A1和A2β-CN变异体。由于I与A2在产生BCM-7的意义上都类属于A2型,且一般含量很低,在样品中即使I和A2没能分离,将I定量于A2中也是可以接受的。而B和C的共迁移不影响A2β-CN和总β-CN的定量。(2)与整蛋白LC-HRMS中各个峰面积对比来进一步确认对各个变异体峰的鉴定。由于整蛋白LC-HRMS可以准确测定各个变异体的相对分子质量并对其进行相对定量,因此我们将CE和整蛋白LC-HRMS方法分析β-CN各变异体的相对峰面积结果进行比较(见表2)。结果表明,按照理论推断的出峰顺序鉴定出来的各变异体的校准峰面积,与整蛋白LC-HRMS对应的各变异体校准峰面积一致。进一步确定了β-CN各变异体的迁移时间顺序为B、A1和A2。

图 2 CZE方法分析除β-CN外其他主要牛奶蛋白标准品混合物的电泳图Fig. 2 Electropherogram of main milk protein standards except of β-CN CE conditions were the same as those in Fig. 1. Peaks: 1. β- lactoglobulin; 2. bovine serum albumin; 3. α-lactalbumin; 4. lactoferrin; 5. IgG; 6. αS1-CN; 7. αS2-CN.

图 3 CZE方法分析(a) A2巴氏奶和(b)普通(A1/A2)巴氏奶的电泳图Fig. 3 Electropherograms of (a) A2 pasteurized milk and (b) A1/A2 pasteurized milk by CZE CE conditions were the same as those in Fig. 1. Peaks: 1. αS1-CN; 2. αS2-CN; 3. B β-CN; 4. A1 β-CN; 5. A2 β-CN.

表 1 5种主要β-CN变异体中氨基酸序列的差别

Data from https://www.uniprot.org/uniprot/; the different amino acid was highlighted as italic.

表 2 CE和LC-HRMS方法分析β-CN标准品中B、A1和A2变异体的校准峰面积

2.5 A2巴氏奶和普通巴氏奶的CE分析

图3a是典型的A2巴氏奶的电泳图。β-CN变异体峰根据β-CN标准品得以鉴定,在B(峰3)与A2β-CN(峰5)之间有多个低含量的峰。根据之前的研究[14,17,18],在B与A2β-CN之间无β-CN外的其他蛋白峰,因此这些低含量的峰应为其他β-CN变异体的峰。由于本方法仅测定A2β-CN和总β-CN的含量,无需单独对这些变异体峰进行分别鉴定及定量,将其峰面积一起计算到总β-CN即可。比较图3中A2巴氏奶和普通巴氏奶,可以明确地看出两款巴氏奶样品中β-CN各变异体分布的区别和A2β-CN含量(峰5)的区别。经对不同生产厂家、不同批次的3份A2巴氏奶进行测定,3份样品中A2β-CN占总β-CN的峰面积百分比均大于92%。

2.6 对发生美拉德反应的β-CN变异体的定量

在高温喷粉制成奶粉或对液态奶进行超高温杀菌的过程中,乳制品中的蛋白与乳糖会发生反应。一个蛋白可能结合一个、两个或多个乳糖,生成不同的糖化产物,这类反应叫作美拉德反应。这些美拉德反应产物具有与蛋白变异体不同的电荷/体积比,比蛋白变异体略晚出峰,形成蛋白变异体和其美拉德反应产物的多峰组。该现象在毛细管凝胶电泳分析乳制品中也有出现[20]。图4中的a是经喷粉工艺得到的A2全脂奶粉样品的CE图;b是A2巴氏奶的CE图。该图比较了同是A2奶源,没有美拉德反应(巴氏奶,b)与发生了美拉德反应(奶粉,a)的乳制品的出峰差别。

表 3 日内和日间精密度

*g/L for milk; g/100 g for milk powder. RSD(r): intraday RSD; RSD(I): interday.

图 4 CZE方法分析(a) A2全脂奶粉和(b) A2巴氏奶的电泳图Fig. 4 Electropherograms of (a) A2 whole milk powder and (b) A2 pasteurized milk by CZE CE conditions were the same as those in Fig. 1. Peaks: 1. αS1-CN; 2. αS2-CN; 3. A2 β-CN; 4. A2 β-CN with one lactose; 5. A2 β-CN with two lactose.

图 5 CZE方法分析(a)普通(A1/A2)脱脂奶粉和(b) A2全脂奶粉的电泳图Fig. 5 Electropherograms of (a) A1/A2 skim milk powder and (b) A2 whole milk powder by CZE CE conditions were the same as those in Fig. 1. Peaks: 1. αS1-CN; 2. αS2-CN; 3. A2 β-CN; 4. A2 β-CN with one lactose; 5. A2 β-CN with two lactose; 6. B β-CN; 7. A1 β-CN.

在经过热喷粉制得的奶粉或经过热加工的液态奶中,虽然蛋白与乳糖发生了美拉德反应,形成了蛋白及其美拉德反应产物的多峰组,但该方法依然能够将β-CN的主要变异体峰组实现基线分离,如图5中普通(A1/A2)脱脂奶粉所示。对于此类乳制品,使用A2β-CN变异体及其各个美拉德反应产物峰的峰面积之和来计算A2β-CN的含量。

2.7 方法验证

2.7.1线性范围、检出限和定量限

用β-CN标准品配制6个浓度水平的标准溶液,制作总β-CN校准峰面积与浓度的线性曲线。根据1.7节方法计算出A2β-CN的浓度,制作A2β-CN校准峰面积与浓度的线性曲线。总β-CN和A2β-CN在0.3～12.1 g/L和0.2～7.7 g/L内,线性相关系数(r2)均大于0.995,LOD分别为0.1 g/L和0.067 g/L,LOQ分别为0.3 g/L和0.2 g/L。

2.7.2方法的日内和日间重现性验证

采用A2巴氏奶、普通(A1/A2)巴氏奶、A2全脂奶粉和普通(A1/A2)脱脂奶粉样品进行了重现性测试,结果见表3。验证数据显示:A2β-CN和总β-CN的日内精密度RSD (r)分别为2.4%～4.7%和2.6%～4.8%;日间精密度RSD (I)分别为4.0%～6.3%和3.9%～6.7%。

2.7.3回收率

A1脱脂奶粉中不含A2β-CN,并且其他物质和蛋白含量与A2奶相似,适于做A2加标回收率测定的本底。因此,以一份从爱尔兰得到的A1脱脂奶粉的水溶液作为本底(A1β-CN终含量约为0.99 g/L),分别加入两个浓度水平(A2β-CN终含量分别为1.52 g/L和0.76 g/L)的A2巴氏奶和A2全脂奶粉,测定A2和总β-CN的添加回收率,用以评价本方法的准确度。其中A2和总β-CN的理论值和加入A1脱脂奶粉后的计算值均通过校准曲线求得。结果表明,A2巴氏奶中A2β-CN和总β-CN的回收率分别97.1%～106.4%和98.7%～94.6%; A2全脂奶粉中A2β-CN和总β-CN的回收率分别94.4%～101.7%和90.7%～85.5%。数据为3个平行测定的平均值。

2.8 液态奶和奶粉中A2 β-CN和总β-CN的测定

根据文献报道,牛奶中CN的含量占总蛋白质含量的80%,而总β-CN约占CN含量的36%[2],因此可根据乳制品中的蛋白质标签值计算出其中总β-CN的含量(计算值,见表4)。表4中还列出了CZE方法所测得的12个乳制品样品(液态奶和奶粉)中总β-CN含量、A2β-CN含量和A2β-CN占比的结果。将测得的总β-CN含量值与理论计算值进行了比较,获得了一致的结果。被测的A2乳品中,A2β-CN在总β-CN的占比均大于93.9%;而普通乳品(含A1和A2)中,A2β-CN在总β-CN的占比在58.1%～68.8%之间。A2乳品和普通乳品中A2的含量有明显的差异。

表 4 液态奶和奶粉样品中总β-CN、A2 β-CN的含量以及A2 β-CN的占比

* g/L for milk; g/100 g for milk powder. UHT: ultra high temperature.

3 结论

本文经过对毛细管区带电泳分离中缓冲液种类、缓冲液pH、分离温度和添加剂等条件的优化,建立了分离各种β-CN变异体的方法,并利用此方法考察了液态奶和奶粉中A2β-CN和总β-CN的含量,计算了A2β-CN在总β-CN中的含量比例。对于UHT奶和奶粉,虽然在高温杀菌或高温喷粉过程中有美拉德反应产物的生成,但该方法仍可有效地将A2β-CN及其美拉德反应产物从其他的β-CN中分离出来并定量。该方法可根据A2β-CN占总β-CN的含量,有效识别液态奶和奶粉究竟是以A2β-CN为主,还是A1、A2混合型制品。方法以足够的精密度和准确度用于对乳制品中(液态奶和奶粉)的A2β-CN和总β-CN进行分析,是乳制品中A2β-CN和总β-CN含量测定的有效方法。

致谢 我们非常感谢美国Hilmar Ingredients的吴超博士就β-CN的美拉德反应在该方法中可能的表现与我们所做的讨论和给予的帮助!感谢惠氏苏州工厂质控实验室在实验过程中提供仪器和试剂的支持。