液相色谱-同位素比质谱技术发展及应用研究进展

丁 博,谢建军,王志元,陶移文,黄洪波,陈文锐,姚孝宝

(1. 广州医科大学药学院, 广东 广州 511436; 2. 广州海关技术中心, 广东 广州 510623;3. 青海省冬虫夏草协会, 青海 西宁 810007; 4. 青海贡草生物科技有限公司, 青海 西宁 810007)

自1913年英国物理学家汤姆逊首次发现氖稳定同位素以来[1],科学家研究发现自然界中61种元素含有稳定同位素,稳定同位素具有特殊的地理、化学和生物等信息,引起科研工作人员的好奇与兴趣,随着现代物理与化学技术的发展,碳、氮、氢、氧、硫等轻元素的稳定同位素天然丰度的测量手段逐渐形成一种新型同位素分析技术[2],该技术广泛应用于地球科学、古生物学、环境科学、生态学、生理学、司法鉴定、食品质量控制(真实性鉴定与产地溯源)等领域[3]。

1 同位素比质谱简述

1.1 稳定同位素分析

稳定同位素分析是一种根据构成物质的碳、氢、氧、氮、硫等轻元素在物理、化学、生物等外界因素作用下出现同位素分馏现象,进行元素的稳定同位素比测定,追踪物质来源的分析技术。自然界中轻元素的同位素天然丰度都非常小,稳定同位素分析时,所需测量仪器的精密度数量级达到10-6～10-4[4,5],然而,常规四极杆、离子阱、飞行时间等质量分析器的精密度在0.05%～2%之间,达不到同位素测定要求,直接测定样品中特定化合物中轻元素的同位素比值非常困难[6]。于是人们采用转换气体模式间接测定碳、氢、氧、氮、硫等轻元素同位素天然丰度比,比如,通过氢气测氢同位素比,二氧化碳测定碳稳定同位素比,一氧化碳测氧稳定同位素比、氮气测定氮稳定同位素比和二氧化硫测定硫稳定同位素比[7]。为了准确地描述稳定同位素的天然丰度比,20世纪40年代来自芝加哥哈罗德尤里实验室的Mckinney学者首先引入δ值的概念,用来表达稳定同位素丰度比[8]。

δ值定义为稳定同位素天然丰度相对比值[8],样品同位素丰度比(R(hEs/lEs))与国际基准参考物质的同位素丰度比(R(hEref/lEref))差值,除以国际基础参考物质的同位素丰度比,从而得到相对国际基准参考物质的同位素丰度比值,单位为‰。

(1)

其中,R为同位素丰度比值,E为元素,h为重同位素质量数,l为轻同位素质量数,s为样品,ref为国际基准参考物质。比如稳定碳同位素比分析,国际基准参考物质是南卡罗来纳州的白垩纪海洋化石(vienna pee dee belemnite, VPDB),其13C/12C值是0.011 180 2[9],样品中碳同位素比如下:

(2)

1.2 同位素比质谱仪

同位素比质谱仪是由样品进样系统、电子轰击离子源系统、磁场质量分析器系统、多通道法拉第杯检测器系统和计算机数据采集系统等5个系统构成,其中多通道法拉第杯为高通量收集专属离子检测器[3]。比如,碳同位素检测分析时,每个法拉第杯检测器分别检测m/z44、45和46 3种特定离子(见图1)。

图 1 同位素比质谱仪构成示意图Fig. 1 Schematic of isotope ratio mass spectrometry

根据样品进样有无外设装置预处理,可将稳定同位素比质谱技术分为双进气道进样型同位素比质谱(dual inlet-isotope ratio mass spectrometry, DI-IRMS)技术和连续进样型联用同位素比质谱(continuous flow-isotope ratio mass spectrometry, CF-IRMS)技术,其中CF-IRMS包括元素分析-同位素比质谱(elemental analyzers-isotope ratio mass spectrometry, EA-IRMS)、在线气体制备-同位素比质谱(gas bench-isotope ratio mass spectrometry, GB-IRMS)、气相色谱-同位素比质谱(gas chromatography-isotope ratio mass spectrometry, GC-IRMS)和液相色谱-同位素比质谱(liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry LC-IRMS)[2,3]。

1.2.1DI-IRMS

DI-IRMS主要应用于地质年代考究学科领域。为了研究古地球的环境状况,科研工作者借助无脊椎动物有孔虫类沉积化石中碳酸钙的稳定碳和氧同位素比,间接推测地球的演化进程[3,10]。1950年加拿大学者McCrea[11]发明了碳酸盐释放CO2检测氧和碳同位素比的McCrea方法,不久英美学者Shackleton和Opdyke两人[12]利用McCrea方法,直接将碳酸盐释放的CO2引入同位素比质谱仪中检测分析有孔虫类化石稳定氧和碳同位素比,用于推测地球的演化历史。

1.2.2GB-IRMS

GB-IRMS是一种将样品在线制备成CO2与H2等气体后,直接通入稳定同位素比质谱仪中进行稳定碳、氧和氢同位素比的测定方法。主要应用于水中稳定氧和氢同位素比的测定[13]、环境中无机碳和有机碳稳定同位素比测定[14,15],以及CaCO3岩石中碳稳定同位素比测定[16]等领域。GB-IRMS前处理外设装置最早是由美国赛默飞公司生产的第一代Gas-bench设备,现已发展到了第二代Gas-bench Ⅱ设备[17]。

1.2.3EA-IRMS

EA-IRMS是一种检测固态和液态全样品的同位素分析技术,是目前应用最广泛的一种同位素分析技术[18]。δ2H和δ18O的测定原理是高温裂解反应:液体样品直接通过液体自动进样器进样,固体样品用银杯包裹后通过固体自动进样器进样,均是进入1 380 ℃高温裂解炉中进行裂解反应,在玻璃化碳粒还原剂作用下生产H2和CO等混合气体,经过恒温气相色谱柱分离获得纯的H2和CO后,通过ConFlo IV装置进入IRMS主机中,测定样品的δ2H和δ18O。样品δ13C和δ15N的检测原理是高温氧化反应:锡杯包裹的样品通过固体自动进样器进入由Cr2O3氧化剂、Cu还原剂、Ag2Co3O4脱卤素剂、玻璃棉等材料构成的石英燃烧管中,980 ℃高温快速燃烧作用下,将目标物转化为CO2和N2混合气体,经过恒温气相色谱柱分离获得纯的N2和CO2气体依次进入IRMS主机中,测定样品中的δ13C和δ15N[19,20]。当前EA-IRMS通常和GC-IRMS或LC-IRMS联用,测定样品中特征化合物的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值[21,22]。

1.2.4GC-IRMS

1978年两位美国学者Mattews和Hayes[23]设计出了世界上第一台离线的GC-IRMS仪器,应用于样品的特征化合物同位素分析领域中;1984年科研人员又研究开发了在线GC-IRMS仪器,在线分析样品中特征化合物的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O[24],从而实现了GC-IRMS仪器的商业化。自此,GC-IRMS特征化合物同位素分析技术开始广泛应用于地球化学、古生物学、环境化学和食品真实鉴定等领域[25-27]。

GC-IRMS关键部件是GC IsoLink接口设备,决定着GC分离后的目标物是否能进入IRMS主机中,进行目标化合物的稳定同位素比的测定。GC IsoLink主要由高温燃烧管、可移动高温裂解管、气液分离膜装置和参考气体与稀释气体装置等部件构成。在样品的δ13C、δ15N测定时,像Flash EA的高温氧化检测原理一样,用一根燃烧管实现样品中C和N元素的气体转化。测定样品的δ2H和δ18O时,使用GC IsoLink内置不同的O裂解管和H裂解管,分别产生CO和H2气体,其中O裂解管中不像Flash EA裂解管里面填装玻璃碳粒,而是事先将样品碳化而截留下来碳作为还原剂,高温裂解将样品中的O元素成分转化为CO气体;H裂解管中填充铂催化剂,样品中H元素成分,在1 450 ℃高温裂解催化作用下转化H2气体[28]。

1.2.5LC-IRMS

与GC-IRMS相比,LC-IRMS是一种开发应用比较晚的特征化合物同位素分析技术。主要原因是气体稳定同位素比质谱检测分析的对象为相对分子质量小的气体,比如CO2、N2和H2等,而液相色谱经过色谱分离后获得纯的液体化合物,如何将液体化合物转化为待测气体是LC-IRMS面临的一大技术瓶颈。直到2004年Thermo公司的德国技术团队[29]研究开发出了湿法氧化LC Isolink接口设备,实现了LC-IRMS仪器设备的商品化。从此,LC-IRMS走入科研工作人员的视线中,相对于GC-IRMS,LC-IRMS可用于非挥发性化合物的测定,具有样品的非衍生化预处理等技术优势。目前LC-IRMS逐渐地开始应用于食品质量安全、考古学、生命科学、环境科学和地球化学等领域。

2 LC-IRMS概述

2.1 LC-IRMS发展历史

LC-IRMS是同位素比质谱家族中最晚研究开发出来的一种商业化仪器,但是却有着十几年的技术研发历史。1993年美国Caimi和Brenna[30]两位学者最早开发了LC与IRMS联用仪器设备,他们设计出了用可移动金属丝装置去除溶剂和燃烧目标分析物的LCM-2接口设备。其工作原理是液相色谱的流出组分首先通过Cu和Pt涂层的移动金属丝,在150 ℃干燥室作用下,蒸发去除流动相溶剂,接着金属丝移动至高温燃烧室,高温燃烧将目标物转化成CO2气体,一定程度上解决了样品的溶剂去除及目标物的气体转化等技术瓶颈,实现了LC与IRMS直接联用;但是该接口设备在实际样品的测定时,有着回收率与准确度低,设备使用寿命短等致命缺陷。1996年Brand等学者[31]改进了早期的移动金属丝接口设备,提高了接口设备的使用寿命与检测灵敏度,目标化合物的绝对碳含量达20 pg以上,即可检测到样品中特征化合物的δ13C。同年,Teffera技术团队[32]设计出了化学反应接口设备,该设备的工作原理是液相色谱流动相依次经过驱除溶剂的喷雾器,雾化气体在反应室内纵向扩散,接着通入氧气,将目标物全部氧化成CO2气体,采用动量分离器分离气体与液体,待测CO2气体干燥进入IRMS主机,进行目标化合物的δ13C测定。

2004年Thermo公司的Michael Krummen技术团队[29]研究开发了第一款商品化的LC-IRMS接口设备——LC IsoLink装置,克服了以往接口设备准确度低、氧化不充分和同位素分馏效应等技术缺陷问题。该接口设备由氧化反应管、冷却器、气液分离单元、气体干燥器和气体开发分流器5个单元构成,采用湿式化学氧化法的工作原理;样品中目标化合物首先经过液相色谱分离后,与磷酸和过硫酸钠溶液混合进入氧化管,在99.9 ℃温度条件下将化合物全部氧化为CO2气体,接着冷却、气液分离与干燥后,最后待测气体进入IRMS主机进行δ13C的测定。2010年英国Isoprime公司的Morrison技术团队[33]设计了第二款商业化的LC-IRMS接口设备Liquiface,该接口设备也是采用湿式氧化方法的工作原理,在液态条件下将目标化合物全部氧化转成CO2气体,与LC IsoLink非常相似,不同的部分是该接口设备多了一个去离子水泵,构成三元泵系统。

2.2 LC-IRMS技术分类

LC-IRMS接口设备的技术原理是目标分析物通过湿式化学氧化法转化为CO2气体,对样品特征化合物的δ13C进行检测分析;因此,该技术严格限制外源碳的引入,导致液相色谱流动相不能用有机溶剂等体系,只能用纯水,以及纯水加入磷酸缓冲液、稀磷酸、稀硫酸或稀氢氧化钠溶液等作为流动相。根据液相色谱分离原理,目前将LC-IRMS分为离子交换色谱、反相液相色谱和混合型色谱等3种联用技术。

2.2.1离子交换色谱联用同位素比质谱技术

自Thermo公司推出了第一款商业化的LC IsoLink接口设备以来,离子交换色谱率先与同位素比质谱仪联用,用于糖类、碳水化合物等特征化合物同位素分析中。该联用技术原理是糖类等碳水化合物可在纯水或低浓度的酸及碱等不含碳源的流动相体系下,通过离子交换色谱柱实现单糖、二糖、多糖等混合物的分离,达到特征化合物δ13C测定的目的。

2.2.2反相液相色谱联用同位素比质谱技术

由于LC-IRMS的液相色谱流动相不能使用有机溶剂的缘故,限制了反相液相色谱与同位素比质谱联用技术的发展。直到2008年,瑞士学者Godin等[34]提出了类似气相色谱的程序升温的高温液相色谱分离技术,实现了反相液相色谱与同位素比质谱的联用。该技术的特点是在高温条件下,降低水的黏度而提高洗脱能力,使其达到有机溶剂的洗脱能力[35]。目前,反相液相色谱联用同位素比质谱技术越来越多的应用于非挥发的特征化合物同位素分析领域之中。

2.2.3混合型色谱联用同位素比质谱技术

美国SIELC公司推出反相C18与离子交换基团复合型Primesep系列色谱柱产品,此类色谱柱具有离子交换作用和反相C18吸附解吸的作用,在低温及纯水流动相条件下,实现小分子化合物的分离,促使了一种新型的特征化合物同位素分析技术的产生。该LC-IRMS技术比较适合复杂基质样品的测定,极大地拓宽了LC-IRMS特征化合物同位素分析的应用范围。

3 国外LC-IRMS的研究进展

自从商业化的LC IsoLink接口设备问世以来,LC-IRMS逐渐地开始应用于食品安全、环境科学、生态学、考古学、生命科学等领域,尤其是食品安全和环境科学两个学科领域(见表1)。

3.1 食品安全

食品安全问题一直是国内外消费者关注的头等大事,从早期关注农药残留、兽药残留、添加剂、重金属等污染物的问题,到近20年来,开始关注食品真实性及溯源的问题。欧盟是世界上最早开展食品真实性、欺诈问题研究的国家地区,2013年举行的欧洲食品质量安全会议中,明确提出了重点关注橄榄油、鱼类、有机食品、牛奶、谷类、蜂蜜、咖啡与茶、调味料、红酒和果汁饮料等十大产品的欺诈问题,并制定了相关的检测方法[43],其中同位素技术由于其独特的追踪溯源特点,在食品真实性及欺诈检测领域中备受科研工作者的关注与重视。比如,西班牙学者González-Martin等[51]利用稳定同位素技术测定伊比利亚猪肉的δ13C值,以此判定市场流通的猪肉食品是否为伊比利亚猪肉。

表 1 近3年来LC-IRMS的应用情况

LC-IRMS作为一种特征化合物同位素分析技术,最早应用于食品的真实性鉴定领域之中。2006年西班牙学者Cabaero等[21]利用LC-IRMS检测蜂蜜中葡萄糖、果糖及蔗糖的δ13C值,结合EA-IRMS测定蜂蜜的总样品和蛋白质δ13C值,根据δ13C值判定蜂蜜的掺杂问题,在此基础上优化了美国分析化学家协会的标准分析方法(AOAC 998.12),克服了蜂蜜的全样品同位素分析技术存在的误判问题。德国的两位学者Elflein和Raezke[52]利用EA/LC-IRMS测定451个纯蜂蜜和掺杂蜂蜜样品的全样品(honey)、蛋白质(protein)、葡萄糖(glucose, glu)和果糖(fructose, fru)的δ13C值,其中全样品和蛋白质的δ13C值采用EA-IRMS测定,葡萄糖和果糖的δ13C值采用LC-IRMS测定,归纳整理出了δ13C值鉴定蜂蜜掺杂问题的3个指标条件:-2.1‰<δ13CEA-max-δ13CLC-max<2.1‰, -1‰<δ13Cfru-δ13Cglu<1‰,δ13Cprotein-δ13Choney≥-1‰,同时满足这3个指标参数的蜂蜜为纯蜂蜜,否则为掺杂蜂蜜。2008年Cabaero等[53]又利用LC-IRMS和GC-IRMS技术检测红酒中乙醇的δ13C值,并与传统的EA-IRMS方法相比,结果表明LC-IRMS和GC-IRMS特征化合物同位素分析技术显著地提高了样品的检测效率,特别是LC-IRMS技术,30 min内实现了红酒中乙醇δ13C值的测定(见图2)。

图 2 LC-IRMS检测红酒中乙醇的δ13C值[53]Fig. 2 δ13C value of ethanol in a wine sample by LC-IRMS[53]

英国和德国两国学者[54]利用LC-IRMS检测虹鳟鱼中氨基酸的δ13C值,以此探讨虹鳟鱼的蛋白质合成途径及其营养价值。Zhang等[55]利用LC-IRMS检测咖啡因的δ13C值,在纯水流动相与高柱温色谱分离条件下,利用Waters Xbridge C18反相液相色谱柱分离咖啡、茶叶及饮料中的咖啡因,IRMS测定咖啡因的δ13C值,获得天然咖啡因的δ13C值分布范围(-25‰～-32‰)以及人工合成咖啡因δ13C值分布范围(-33‰～-38‰),以此判断市场上销售的饮料是否为天然来源产品。法国学者Guyon等[56]利用LC-IRMS检测柠檬汁中有机酸、葡萄糖和果糖的δ13C值,在80 ℃柱温和纯水流动相条件下,采用Carbohydrate 700 CH糖柱分离柠檬汁中有机酸、葡萄糖和果糖等特征化合物成分,获得样品中特征化合物的δ13C值,以此判断柠檬汁是否掺杂了C4植物来源的有机酸或糖。意大利学者Bononi等[57]采用LC-IRMS检测巧克力及巧克力食品中香兰素的δ13C值,判别香兰素是否为天然来源。

3.2 环境与生态学领域

除了食品真实性鉴定领域之外,LC-IRMS也应用于环境科学与生态学领域中。德国学者Heuer等[58]首次将LC-IRMS技术应用于环境科学领域中,检测海洋沉积物孔隙水中挥发性有机酸的δ13C值,根据碳同位素指标信息评价海洋沉积物中厌氧代谢物的产生、迁移与转化规律。美国学者Brandes[59]利用LC-IRMS快速检测海洋中溶解无机碳的δ13C值,用于预测一定区域生态环境中海洋系统吸收人类活动产生的碳排放量的情况。法国学者Albéric[60]提出用LC-IRMS检测河流与土壤水中溶解有机碳的δ13C值,并与有机碳分析仪的测定方法相比,结果表明LC-IRMS是一种准确度高的溶解有机碳的测定方法。美国和瑞士研究人员[61]利用LC-IRMS检测特征化合物苯多羧酸的δ13C值,获得土壤中高温有机质的化学属性、储量及转化率等信息,用于环境污染物的治理、有机肥料使用等相关领域的评估研究之中。德国学者Indorf等[62]利用LC-IRMS检测植物与真菌体内特征化合物氨基葡萄糖的δ13C值,用于研究腐生真菌的形成与迁移过程。Scheibe等[63]利用LC-IRMS检测土壤中溶解有机质的碳同位素比及碳含量,以此研究土壤中有机质对碳运输、储存及释放等碳循环的影响。Kujawinski等[64]利用高温LC-IRMS检测土壤、水体等环境中草甘膦及其代谢产物氨甲基磷酸的δ13C值,鉴定环境中草甘膦除草剂污染物的来源及代谢路径。德国学者Gilevska等[65]利用HPLC-IRMS测定极性氯化物的δ13C值,构建了一种准确度高的氯化污染物检测分析方法,以评估公共卫生环境中氯化物的污染情况(见图3)。

图 3 HPLC-IRMS检测氯化乙酸污染物的δ13C值的流程图[65]Fig. 3 Scheme of the HPLC isotope ratio mass spectrometry system for halogenated compounds[65]

LC-IRMS还应用于环境污染物的迁移转化机理研究之中。Birkigt等[66]运用LC-IRMS检测磺胺甲恶唑等污染物的δ13C值,探讨磺胺甲恶唑的细杆菌生物降解和光催化降解等两种途径,研究发现稳定碳同位素比可准确地追踪磺胺甲恶唑的降解过程。Wei等[67]利用LC-IRMS测定苯酚和对甲酚的δ13C值,通过苯酚和对甲酚的需氧微生物和厌氧微生物降解的稳定碳同位素分析,最终阐明了污染物的需氧及厌氧微生物降解机理。美国学者Powers等[38]运用LC-IRMS检测天然水体中溶解有机碳及其光降解产物溶解无机碳的δ13C值,构建一种天然水体中光降解产物溶解无机碳的定量分析方法。

3.3 生命科学领域

LC-IRMS特征化合物同位素分析技术不但广泛应用于食品、生态环境领域,还应用于生命科学领域之中。瑞士学者Godin等[68]首次将LC-IRMS应用于血管紧张素Ⅲ和亮氨酸δ13C值的测定,构建低浓度生物大分子和小分子化合物的δ13C分析方法。Schierbeek等[69]利用LC-IRMS检测新生儿体内甘氨酸及甘氨酸二肽的δ13C值,用于研究新生儿体内谷胱甘肽的动力学合成过程。澳大利亚学者Tea等[70]运用EA-IRMS、GC-IRMS和LC-IRMS研究乳腺癌细胞代谢物的碳和氮稳定同位素比时,选择RS park KC-811离子排阻色谱柱,纯水流动相洗脱分离细胞代谢物,从而检测细胞代谢物的δ13C值。Moerdijk-P等[71]利用LC-IRMS检测DNA和RNA中核苷酸的δ13C值,用于追踪分析DNA和RNA的生物化学合成路径。英国学者Morrison等[72]利用LC-IRMS检测血液中葡萄糖和半乳糖的δ13C值,探讨机体运动期间血液中半乳糖与葡萄糖的代谢转换机理。

3.4 考古学

在考古学研究领域中,LC-IRMS常用于检测分析骨头或头发等组织中氨基酸的δ13C值,重现古人类的饮食习惯。英国学者McCullagh等[73]首次利用LC-IRMS检测分析人与动物骨头胶原蛋白中18种氨基酸的δ13C值,重构了古人类的肉食生活习惯。德国学者Choy等[74]利用LC-IRMS检测9个人类和22个动物样品骨头胶原蛋白中氨基酸的δ13C值,发现Tongsamdong和Nukdo两地的人与动物体内必需氨基酸和非必需氨基酸具有相似的分布规律,海洋动物的δ13C值相对陆地动物具有较高的同位素富集效应,人类氨基酸的δ13C值置于海洋动物与陆地动物δ13C值之间,据此判定不同地方古代人类的食物类型是海洋或陆地来源。澳大利亚和智利两国科研人员[37]利用LC-IRMS检测木乃伊头发中角质蛋白中氨基酸的δ13C值,重现了古人类的饮食结构,用于推测古第四纪的人类栖息迁移历程。

3.5 其他应用领域

除了上述4个领域之外,LC-IRMS还应用于标准物质纯度分析鉴定、司法鉴定以及地球科学等领域。西班牙学者Diaz等[75]利用LC-IRMS分析人工合成多肽标准物质的纯度,并与氨基酸分析方法以及ICP-MS方法相比,研究显示LC-IRMS分析结果符合美国国际标准技术研究所标准品NIST8327的要求。比利时学者Janssens等[76]综述了稳定同位素技术在天然的内生雌激素和人工合成雌激素之间差异鉴定中的研究进展,并指出LC-IRMS可应用于兴奋剂检测等司法鉴定领域之中。澳大利亚和法国两国学者[77]还将LC-IRMS拓展应用到地球科学领域,用于检测次生沉积岩中有机质等特征化合物的碳同位素比,以此探索古地球环境中气候与地表植物的变化。

4 近年来国内IRMS的研究进展

1996年熊永强和耿安松[78]在国内杂志上发表了一篇有关同位素比质谱技术的论文,综述GC-IRMS在地球化学中的应用情况。自此,国内科研工作者开始了同位素比质谱技术的相关技术研究工作。2000年汪聪慧等[79]率先利用同位素比质谱测定硝铵炸药TNT的来源,将同位素比质谱技术应用到司法犯罪证据调查领域。目前国内关于同位素比质谱技术的研究主要集中在GasBenchⅡ-IRMS、GC-IRMS和EA-IRMS等技术领域,LC-IRMS方向的研究甚少,以下概述分析国内IRMS的研究进展。

4.1 同位素比质谱技术的研究状况

GasBench-IRMS侧重于稳定氢和氧的同位素比测定,广泛应用于环境科学领域。王华等[80]运用GasBenchⅡ-IRMS进行环境水体中氢和氧稳定同位素比的研究,采用CO2-H2O平衡法和铂催化H2-H2O平衡法测定水体中δ18O和δD,实验室间的比对分析数据表明GasBenchⅡ-IRMS测定δ18O和δD的方法具有较高的准确度和精密度。徐胜等[81]利用GasBenchⅡ-IRMS测定新鲜橙汁中水的稳定氧同位素比,判断市场上销售的橙汁真伪。郑敏芳等[82]通过改造GasBenchⅡ-IRMS仪器系统,使其可以测定氮稳定同位素比,应用于海水中硝酸盐的15N和18O的检测。

EA-IRMS是国内应用最广泛的一种同位素比质谱技术,近年来EA-IRMS技术主要应用于食品与农产品的溯源及真假鉴定领域中。梁莉莉等[83]采用EA-IRMS追踪分析婴幼儿配方奶粉的奶源产地,研究结果显示δ13C和δ15N与奶粉的产地来源具有显著的相关性。谭梦茹等[84]利用EA-IRMS检测葡萄汁中δ13C值,根据葡萄汁中糖和有机酸的δ13C的差值范围(-1.63‰～0.72‰)鉴定葡萄汁的真假。王修宁等[85]运用EA-IRMS测定食醋总碳的δ13C值,根据δ13C值判断芳香醋、糯米酿造食醋和苹果醋等醋的类型。费晓庆等[86]根据EA-IRMS检测蜂王浆中碳稳定同位素比值,通过蜂王浆蛋白质和蜂王浆总样品的δ13C值鉴定蜂王浆的真假,当Δδ13C ≥-0.95 ‰,蜂王浆总样品的δ13C≤-21.5‰时,判定此类产品为纯正的蜂王浆,否则为掺杂品。卢安根等[87]采用EA-IRMS分析牛磺酸的碳和氮稳定同位素比,依此判断南珠贝肉的真实性,结果显示δ13C和δ15N与牛磺酸的含量呈现负相关。金贵善等[88]采用EA-IRMS测定有机氮和无机氮的δ15N,研究结果表明δ15N测量的准确性与所选择的标准品化学性质相关。碳、氢、氧等轻元素的稳定同位素比测定一般选择同位素比质谱技术,近年来还出现了核磁共振技术和同位素比质谱技术联用一起用于样品同位素比值的测定,其中核磁共振技术主要根据特异性天然同位素分馏-核磁共振技术原理进行样品稳定同位素比的测定[89]。

GC-IRMS是一种特征化合物同位素分析的检测技术,广泛应用于食品、生态科学、地质科学、兴奋剂检测等领域之中。赵孔祥等[90]运用GC-IRMS检测葡萄酒中乙醇、甘油、异戊醇、乳酸乙酯、乙酸和2,3-丁二醇等特征化合物的δ13C值,依此判断不同地区来源的葡萄酒。郭莲仙等[91]先采用脂肪酸甲酯化前处理植物油和动物油等食用油中的甘油三酯成分,再利用GC-IRMS检测甲酯化后甘油三酯的δ13C,以此判断植物油和动物油的差别。吴浩等[92]利用GC-IRMS测定葡萄酒中乙醇、丙三醇、乙酸、乳酸乙酯和2-甲基丁醇的δ13C值,构建δ13C判别分析模型鉴别葡萄酒的产地来源。陈航等[93]根据GC-IRMS分析白酒中乙醇的δ13C值,发现酱香型白酒中乙醇的δ13C值范围是-19.53‰～-19.11‰,根据δ13C值分布区间判断白酒真伪和掺假问题。赵超敏等[94]运用GC-IRMS检测分析黄油中5种类固醇激素的δ13C值,单因素方差分析结果显示内源性孕酮和外源性孕酮具有显著的差异性。在生态科学研究领域方面,赵晶晶等[95]根据GC-IRMS测定氨基酸的氮稳定同位素比,通过氨基酸的衍生化处理,进行氨基酸特征化合物的δ15N值分析,判定水生生物的营养级别。在地质科学领域方面,雷知生等[96]利用GC-IRMS检测天然气水合物气体中碳和氢稳定同位素比,构建天然气水合物样品中烃类气体碳氢同位素检测分析方法,鉴别天然气水合物的构成成分。王希彬等[97]利用GC-IRMS测定天然气中微量烃类化合物成分,构建固相微萃取联用GC-IRMS的烃类化合物同位素分析方法。在兴奋剂药物的检测方面,王静竹等[98]建立了GC-IRMS检测运动员尿液中19-去甲雄酮和19-去甲本胆烷醇酮δ13C的分析方法,鉴定运动员体内的兴奋剂类型是内源性物质或是外源性物质,从而判断运动员是否服用了违禁的兴奋剂药物。

4.2 LC-IRMS技术的应用进展

LC-IRMS是最新的一种特征化合物同位素分析技术,目前国内的研究报告甚少,大约发表17篇相关的科研论文,主要集中在食品真实性检测与溯源领域。2011年国内首次报道了LC-IRMS结合EA-IRMS测定蜂蜜的δ13C,采用Ca离子交换色谱柱分离果糖和葡萄糖,研究结果显示,当蜂蜜样品满足蜂蜜蛋白质与蜂蜜的Δδ13C值≥-0.95‰,果糖和葡萄糖的Δδ13C值在-0.64‰～-0.53‰之间,各组分间的最大Δδ13C值<2.09‰等3个条件,判定样品为纯的蜂蜜产品,该研究结论与国际报道的蜂蜜δ13C值判定标准相一致[99]。罗东辉等[100]也采用LC-IRMS和EA-IRMS鉴定蜂蜜产品的真假,运用氨基柱色谱柱分离蜂蜜中单糖、二糖和三糖等成分,根据样品Δδ13C判定蜂蜜是否掺杂了C4植物糖浆。同年李学民等[101]根据单一的LC-IRMS方法测定蜂蜜中糖组分的δ13C值,利用Phenomenex Rezek RCM(Ca2+)分离果糖、葡萄糖、二糖和三糖,根据蜂蜜中糖的δ13C差值范围,判定蜂蜜是否掺杂了外源糖成分。此外,还有其他学者也采用LC-IRMS和EA-IRMS联合技术检测蜂蜜中蛋白质、果糖、葡萄糖、二糖和三糖,根据不同组分间Δδ13C值的范围,判别蜂蜜是否掺杂了外源糖成分[102-105]。

LC-IRMS技术除了应用于蜂蜜的真假鉴定方面之外,还应用于果汁的真假鉴定领域之中。李鑫等[106]采用LC-IRMS检测橙汁中果糖、葡萄糖、二糖和多糖的δ13C值,通过人工压榨和掺杂两种方法制备待测果汁样品,LC-IRMS测定样品中糖组分的δ13C值,研究结果显示LC-IRMS分析方法可鉴定果汁的掺假问题。谭梦茹等[107]根据LC-IRMS和EA-IRMS检测分析苹果汁中果糖、葡萄糖、二糖、寡糖、有机酸的δ13C,依据各个特征化合物的δ13C差值范围,判断苹果汁是否掺杂了外源糖成分。由此可见,果汁的掺杂鉴定问题与蜂蜜掺杂判别标准相似,根据果汁的特征化合物δ13C值可鉴定果汁产品的真实性。

LC-IRMS技术还应用于酒类和食醋的真假鉴定领域之中。李学民等[108]利用LC-IRMS检测葡萄酒中甘油和乙醇的δ13C值,采用H+离子交换色谱柱分离甘油和乙醇成分,研究结果显示葡萄酒中甘油和乙醇的δ13C值分别是-26.87‰～-32.96‰和-24.06‰～-28.29‰,两者的δ13C值呈现正相关性,以此判定葡萄酒的掺杂问题。LC-IRMS还用于检测白酒中乙醇的δ13C值,根据δ13C值信息判断白酒真伪[109]。在食醋的真假鉴定方面,LC-IRMS主要用于分析食醋中的有机酸成分。李鑫等[110]采用反相Spursil C18色谱柱分析生物发酵来源乙酸和乳酸的δ13C值,以及工业合成来源乳酸的δ13C值,研究结果表明两者之间有显著性的差异,可用于食醋的真假鉴定领域。王奇等[111]利用LC-IRMS检测山西和镇江两地生产的食醋中苹果酸和乳酸成分,利用有机酸专用柱Prevail Organic Acid分离苹果酸和乳酸,IRMS测定这两种特征化合物的δ13C,将所得有机酸δ13C值数据进行聚类分析,研究表明根据有机酸的δ13C值可鉴别山西和镇江两地来源的食醋。此外,还有学者运用LC-IRMS检测山西陈醋、镇江香醋、白醋和米醋中乳酸与乙酸的δ13C值,反相亲水的Zorbax SB-Aq色谱柱分离乳酸和乙酸特征化合物成分,单因素方差分析乳酸和乙酸的稳定同位素数据,结果表明该检测方法可鉴定食醋产品来源的真实性[112]。

LC-IRMS还应用于标准物质和咖啡因等特征化合物的鉴定分析领域。李潇等[113]利用LC-IRMS检测乙醇的δ13C值,研制玉米和木薯来源乙醇的稳定碳同位素标准物质产品,探讨LC-IRMS、GC-IRMS和EA-IRMS等不同技术的稳定碳同位素比的测量准确度;研究结果显示LC-IRMS可应用于标准物质的研制领域。我们的课题研究团队将LC-IRMS技术应用于咖啡因的δ13C值的测定,反相Xbridge Shild RP C18色谱柱分离咖啡因等生物碱特征化合物成分,在较低的柱温以及纯水流动相条件下,实现了特征化合物咖啡因的δ13C值测定[114]。

5 LC-IRMS的技术局限与挑战

目前LC-IRMS在各个学科领域中有着一定的应用与发展,但是该技术却具有显著的漏洞与不足。2011年Godin和McCullagh两人[115]评述了LC-IRMS存在的技术局限性:(1)液相色谱与同位素比质谱接口设备仅适合水性的流动相,限制了LC-IRMS技术的应用;(2)由于流动相最大流速不能超过0.7 mL/min,导致了色谱分离保留时间比较长;(3)接口设备中湿法氧化反应器的寿命与更换问题;(4)接口设备中磷酸酸化剂和过硫酸钠氧化剂的泵缺少流量压力表,无法实时显示压力,不利于故障排查问题。总之,LC-IRMS技术具有一定的技术局限,整理归纳起来主要分为两大技术问题,一是液相色谱使用条件的局限问题,二是样品的稳定同位素比检测类型的单一问题,目前成熟的商品化LC-IRMS仪器仅仅适合于δ13C的检测。

5.1 液相色谱使用条件的局限性

目前LC-IRMS主要适用于特征化合物δ13C的检测,要求液相色谱流动相体系中不能含有碳成分,导致不能使用有机溶剂流动相,极大地限制了液相色谱柱的选择范围,国内外学者主要选择离子色谱柱、糖柱及复合型色谱柱等类型的色谱柱,用于LC-IRMS特征化合物同位素分析领域之中,其中复合型色谱柱主要指SeLIC公司生产的Primesep系列规格的色谱柱[116],应用最广泛的反相C18色谱柱被排除在外,通常情况下不能用于LC-IRMS的检测分析领域中。2008年瑞士学者Gold等[34]首次提出了采用升高温度的方法,克服纯水或水系缓冲液流动相洗脱能力低的问题,但是也未将反相C18液相色谱柱应用于LC-IRMS检测之中。2011年Zhang等[55]改进了高温-液相色谱-同位素比质谱(HT-LC-IRMS)分析技术,突破了LC-IRMS不能使用反相C18色谱柱的限制性问题。我们的课题组研究表明,在较低温度(55 ℃)色谱柱柱温条件下,反相C18色谱柱也适用于LC-IRMS的稳定同位素分析检测领域之中[114,117]。

尽管反相C18色谱柱已经可以应用于LC-IRMS特征化合物同位素分析领域之中,但是仅仅限于亲水性化合物,大量的疏水性化合物仍然被排除在外。由此可见,有待进一步研究解决LC-IRMS存在的液相色谱使用条件的局限性问题。

5.2 稳定同位素比测定类型的局限性

目前美国赛默飞公司生产的LC IsoLink接口设备和英国Isoprime公司的Liquiface接口设备均采用磷酸和过硫酸钠湿法氧化还原的原理,将样品中所有的碳成分转化为CO2,进行碳元素的δ13C检测,而常见的氮、氢和氧等轻元素不适用于当前的LC-IRMS仪器设备。

为了克服LC-IRMS不能用于氮等其他元素同位素比测定的问题,国内外科研工作人员进行了相关的仪器研发工作。文献报道显示,2016年德国科研人员率先在实验室条件下,改造了LC与IRMS接口设备,在850 ℃高温和Pt催化剂条件下,通入氧气将目标物的碳成分全部转化成CO2气体,接着在500 ℃温度与Cu催化条件下,将目标物的氮成分还原生成N2气体,降温冷却分离气体与液体,最终实现了LC-IRMS检测样品特征化合物的δ13C和δ15N值(见图4)[118]。

总之,未来LC-IRMS技术的研究重点方向一是改进与完善液相色谱分析条件,在现有的商业化LC-IRMS仪器设备基础上,拓展到疏水性化合物δ13C的检测领域中;二是改进LC与IRMS接口硬件设备,使目前单一δ13C的测定扩展到δ15N的检测,获得更多更全面的特征化合物稳定同位素信息数据。

图 4 HPLC-IRMS特征化合物同位素分析的仪器系统配置图[118]Fig. 4 System setup for compound specific isotopic analysis (CSIA) using HPLC-IRMS CSIA[118]

6 结论

LC-IRMS技术自开发以来,广泛地应用于食品真实性的鉴定及产地溯源、环境污染物的检测、生命科学以及考古学等学科领域之中,在非挥发性物质的稳定碳同位素的研究领域,具有独特的优势与应用价值。然而,LC-IRMS也存在流动相体系中不含碳成分,色谱柱选择范围狭小等液相色谱使用条件的限制问题,以及稳定同位素比检测类型单一的技术局限问题。未来还需要进一步改进LC与IRMS接口设备,以及优化液相色谱的分析条件,提高LC-IRMS特征化合物同位素分析技术的通用性、稳定性和准确性。