自制混合型小柱净化-高效液相色谱-串联质谱法同时测定尿液中有机磷酸酯代谢物和8-羟基-2′-脱氧鸟苷

李 栋,张 芹,张圣虎,徐 诚,陈建秋,刘艳华,宋宁慧*,郭瑞昕*

(1. 中国药科大学工学院, 江苏 南京 211198; 2. 生态环境部南京环境科学研究所, 江苏 南京 210042)

有机磷酸酯(OPEs)作为多溴联苯醚类溴代阻燃剂主要替代品,近年来被广泛应用于各个领域[1],由于主要以物理掺杂方式添加入产品,极易释放到各环境介质中,其在自然环境中的暴露达μg/L、μg/kg级别[2-5]。据相关研究报道,OPEs具有神经毒性、内分泌干扰、致畸性和潜在致癌性等多种毒性危害[6-8],对人体健康造成潜在威胁。

研究发现,OPEs可通过呼吸、皮肤接触、摄入等途径进入人体[5],被吸收后会脱去侧链,主要代谢为以磷酸二苯酯等为代表的磷酸二酯化合物,后通过尿液等途径排出体外[9-11]。同时,当人体暴露于外源性环境污染时,机体会产生大量活性氧并诱导遗传物质DNA氧化应激,从而造成DNA损伤[12],而8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHdG)是DNA氧化损伤的产物,可作为代谢终产物随尿液排出体外[13,14],被广泛用于评估环境污染物引起的人体氧化性DNA损伤程度[15,16]。因此,同时检测人体尿液中OPEs代谢物和8-OHdG,可以更好地评估人体内OPEs暴露水平及其对人体造成的危害。

目前尚未有研究报道同时测定尿液中OPEs代谢物和8-OHdG的方法。单独检测这两类物质的方法,主要以气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)为主,但由于使用GC-MS/MS方法时需要将目标物进行衍生化预处理,过程复杂,不利于大批量尿液样本检测[17-19],而LC-MS/MS因其高选择性和高灵敏度被广泛应用。李佩等[20]利用固相萃取柱-液相色谱-三重四极杆质谱联用技术,测定人尿液中的有机磷酸二酯,检出限为0.005～0.2 μg/L; Kosarac等[21]建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法,测定尿中有机磷系阻燃剂代谢物,检出限为0.08～0.25 ng/mL;王丽英等[14]采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法分析人尿液中8-OHdG的含量,定量限为0.02 ng/mL; Kataoka等[22]建立了全自动在线管内固相微萃取-液相色谱-串联质谱法测定尿液中8-OHdG,检出限为8.3 ng/L。然而单独分析两类物质成本高、耗时长,且由于待测目标物极性差异较大,以及尿液样品基质复杂,采用单纯的商品化固相萃取柱易导致回收率偏低[21,23,24]。

因此,本实验基于对中国环境介质中OPEs污染特征的研究结果,选取检出率较高、浓度较大、较为常见且应用广泛的7种OPEs代谢物,采用自制混合型小柱结合高效液相色谱-质谱技术,建立了同时测定其磷酸二酯代谢物和生物标志物8-OHdG的方法,并将该方法应用于人体尿液实际样品的检测,评价了人体内OPEs暴露水平与氧化损伤的产物8-OHdG之间的关系。该方法为揭示OPEs在体内的代谢方式和暴露量、科学评价OPEs暴露水平与其代谢物以及氧化损伤产物8-OHdG之间的关系提供了研究基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱-串联质谱仪(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity,美国MS-ABSCIEX QTRAP 4500);旋转蒸发仪(R-300,瑞士Buchi公司);恒温氮吹仪(N-EVAP,天津奥特赛斯公司);高速离心机(Centrifuge 5430R,德国Eppendorf公司);数显恒温水浴箱(HH-4,常州国华电器有限公司);数显往复振动摇床(HS510,德国IKA公司);微型漩涡混合仪(WH-3,上海沪西分析仪器厂);电子天平(AG-285,瑞士Mettle公司);超纯水仪(Milli-Q,美国Millipore公司)。

盐酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck公司);氨水(色谱纯,国药集团药业股份有公司);氯化钠(纯度>99%)和无水硫酸钠(纯度>99%)(美国Sigma-Aldrich公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18和石墨化炭黑(graphitized carbon black, GCB)(美国Agilent公司)。

7种OPEs代谢物(磷酸二乙酯(diethyl phosphate, DEP)、磷酸二正丁酯(di-n-butylphosphate, DnBP)、磷酸二苯酯(diphenyl phosphate, DPhP)、双(2-氯乙基)磷酸酯(bis(2-chloroethyl) phosphate, BCEP)、双(1-氯-2-丙基)磷酸酯(bis(1-chloro-2-propyl) phosphate, BCPP)、双(丁氧乙基)磷酸酯(bis(butoxyethyl) phosphate, BBOEP)、双(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯(bis(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate, BDCPP))及8-OHdG标准品均购于百灵威科技有限公司,纯度大于95%,结构式见图1。

上述8种标准品均用乙腈配制成10 mg/L的标准储备液,并配制1 mg/L的8种目标物混合标准储备液,于-20 ℃储存。

图 1 7种OPEs代谢物和8-OHdG的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of seven metabolites of organophosphate esters (OPEs) and 8-OHdG

1.2 样品前处理

取冰冻(-80 ℃)冷藏尿样,于室温下缓慢解冻,涡旋5 min后取10 mL,置于50 mL离心管中,加入4 mL 6 mol/L HCl振荡,80 ℃水浴2 h酸解,冷却至室温;依次加入10 mL乙腈溶液、3 g NaCl,涡旋振荡1 min后离心(8 000 r/min)5 min;取上层5 mL乙腈,转移至自制小柱(小柱由100 mg PSA、20 mg GCB、10 mg C18、4 g无水Na2SO4填充);再用5 mL乙腈淋洗两次,收集的洗脱液置于旋转蒸发仪上旋转蒸发至近干,N2吹干后,用乙腈定容至1 mL,待HPLC-MS/MS测定。

1.3 仪器分析

色谱条件:ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm,美国Agilent公司);柱温:30 ℃;流动相:0.2%(v/v)氨水溶液(A)和乙腈(B);流速:0.3 mL/min;流动相梯度洗脱为0～2 min, 99%A; 2～4 min, 99%A～80%A; 4～5 min, 80%A～60%A; 5～7 min, 60%A～45%A; 7～9 min, 45%A～60%A; 9～9.1 min, 60%A～99%A; 9.1～10 min, 99%A。进样体积:5 μL。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI),负离子模式;多反应离子监测(multiple reaction monitoring, MRM);离子源温度:500 ℃,离子喷雾电压:4 500 V;气帘气(curtain gas, CUR)压力为35.0 kPa;喷雾气(ion source gas 1, GS1)压力为55.0 kPa;辅助加热气(ion source gas 2, GS2)压力为60.0 kPa,其他参数经优化后见表1。

1.4 质量控制与保证

目标化合物根据保留时间和特征离子定性,检测化合物与标准样品的保留时间控制在±2%以内,所对应的选择离子对的峰面积比例控制在±20%以内进行定性确认,并采用最高丰度或背景干扰最少的选择离子进行定量分析。每一组样品(10～15个)中添加1个基质空白、1个样品重复和1个基质加标回收进行质量控制。方法空白样品中目标化合物含量均低于检出限。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

根据7种OPEs代谢物及8-OHdG的分子结构,选择ESI源负离子模式扫描。采用半自动进样方式,将100 μg/L的8种目标物标准储备液分别注入离子源,流速为5 μL/min,分别在ESI+模式和ESI-模式下进行全扫描,结果表明负模式比正模式响应高。分别进行一级质谱扫描,确定[M-H]-峰,然后以分子离子作为母离子,依次进行单离子扫描和子离子扫描,得到目标化合物的定性、定量离子对,并在MRM模式下对目标化合物各质谱参数进行优化,最终质谱参数见表1。

表 1 8种目标化合物的质谱分析参数

* Quantitative ion.

图 2 8种目标物(100 μg/L)的总离子流色谱图Fig. 2 Total ion chromatogram of the eight target compounds (100 μg/L)

图 3 不同固相萃取小柱对回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effect of different solid phase extraction cartridges on the recoveries (n=3)

通常,碱性条件可以提高化合物[M-H]-的离子响应[9,25],本实验采用ESI-模式,分别以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.2%(v/v)氨水溶液和乙腈-0.2%(v/v)氨水溶液作为流动相,考察8种目标物(100 μg/L)的色谱分离效果。结果表明,乙腈比甲醇更容易洗脱目标物,大大缩短了化合物在色谱柱中的保留时间;0.2%(v/v)氨水溶液相比水溶液可明显提高负离子,尤其是8-OHdG的响应值。因此,选择乙腈-0.2%(v/v)氨水溶液为流动相,图2为该流动相下8种目标物(100 μg/L)的总离子流色谱图。

2.2 前处理方法的优化

2.2.1固相萃取柱的选择

由于8种目标物的极性差异较大,而尿液基质复杂,会干扰目标分析物的检测[20,23],因此对样品进行净化至关重要。本研究用乙腈作为萃取溶剂[24],设计了液液萃取结合自制混合小柱的方式,浓缩提取尿液中的目标分析物。自制小柱由PSA、GCB、C18和无水Na2SO4填充,分别考察了该柱与商品化小柱Oasis HLB的萃取效果,各设置3组平行实验。结果表明Oasis HLB小柱对水溶性较大的DEP、BDCPP和BCEP的回收率较低,分别为20%、53%和55%,而自制小柱的萃取回收率在60%～98%之间,能满足痕量分析的要求(见图3)。

2.2.2pH的选择

尿液中,部分代谢产物结合态所占比例较高,根据文献[26],可以使用酸解盐酸化解除轭合态。而正常尿液pH值为5～8,在此状态下磷酸二酯化合物呈现负离子模式,因此适当调节溶液pH为酸性有助于提高萃取尿液中磷酸二酯化合物的回收率[20,23]。故本研究比较了不同pH值对目标物回收率的影响,各设置3组平行实验。如图4所示,当pH分别为4.5、5.0和5.5时,目标物的回收率为23%～95%。pH=5时各目标化合物有较好的回收率,因此最终确定pH为5。

表 2 8种目标物的回归方程、相关系数、日间和日内RSD、检出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

图 4 尿液不同pH值对回收率的影响(n=3)Fig. 4 Effect of different pH values of urine on the recoveries (n=3)

2.2.3GCB用量的选择

GCB对色素、固醇、平面结构的基质具有较强的吸附净化作用[27]。根据本课题组之前的研究[26],先固定PSA的用量为100 mg,考察GCB添加量对目标物回收率的影响,各设置3组平行实验。由图5可知,当GCB添加量分别为10、15、20和25 mg时,目标物回收率为23%～95%;随着GCB用量增加,回收率开始增加,但当GCB的用量为25 mg时，回收率开始降低;仅当GCB的用量为20 mg时，各目标物的回收率为63%～95%，基本符合检测要求，因此最终确定GCB的用量为20 mg。

图 5 GCB的量对回收率的影响(n=3)Fig. 5 Effect of GCB amount on the recoveries (n=3)

2.2.4C18用量的选择

C18键合硅胶由于具有丰富的硅羟基,能形成稳定的Si-O-Si型的化学键,避免固定相流失,另一方面可结合不同的官能团,去除一些油脂等非极性杂质,但萃取极性化合物时,C18反相填料存在渗透吸附容量低、回收率低等问题[28]。本实验中,固定PSA(100 mg)、GCB(20 mg),考察C18用量对回收率的影响。在自制小柱中分别加入5、10、15和20 mg C18,结果显示,随着C18用量的增加,回收率增加,当C18超过10 mg时,回收率基本上不再增加,因此最终确定自制萃取小柱C18的用量为10 mg。

2.3 方法验证

2.3.1标准曲线、方法准确度与精密度

本研究采用外标法定量,分别配制0.1、1、5、10、20、50、100和200 μg/L的8种目标物混合标准溶液,以特征离子响应峰面积为纵坐标(y),目标物质量浓度为横坐标(x, μg/L)绘制标准曲线。如表2所示,目标物在0.1～200 μg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数R2为0.997～0.999。以信噪比S/N=3计算检出限(LOD),S/N=10计算定量限(LOQ),结果表明,7种OPEs代谢物的检出限为0.03～18.33 ng/L, 8-OHdG检出限为13.03 ng/L。同时对10 μg/L标准浓度溶液连续测定3 d,每天测定3次,计算出日间和日内精密度,结果见表2。

2.3.2方法的回收率

在空白尿液(目标物含量低于检出限)中分别添加5、50、100 μg/L 3个水平的目标物,设置5个平行样,按照1.2节所述方法对样品进行前处理,考察方法的精密度与回收率。结果见表3和图6,除DEP外,其他OPEs代谢物的平均加标回收率为72.91%～114.56%, 8-OHdG的平均加标回收率为88.63%～97.72%, RSD为1.9%～9.4%,这可能与DEP有较强的极性与水溶性有关[20]。

2.3.3方法学比较

如表4所示，将本方法与已报道的单独测定OPEs代谢物和8-OHdG的方法进行了比较。结果显示,本方法检出限较低,检测时间较短,有较高的回收率,灵敏且高效,满足定量分析的检测要求。

表 3 加标尿样中7种OPEs代谢产物及8-OHdG的回收率和RSD(n=5)

图 6 (a)空白尿样和(b)加标尿样的总离子流图Fig. 6 Total ion chromatogram of (a) blank urine sample and (b) spiked urine sample

2.4 实际样品分析

从南京市金山医院体检中心随机收集15组成人(20～50岁)晨尿,实际尿样的检测色谱图见图7。使用上述方法测定尿液中7种OPEs代谢物和8-OHdG的含量,如表5所示,除DEP(40%)与BBOEP(13%)之外,其他化合物的检出率均达100%, 7种OPEs代谢物的总和质量浓度范围为6.24～46.07 μg/L,含量稍低于比利时人尿中OPEs代谢物检测值(9.27～54.2 μg/L)[9],但高于广州(0.5～6.7 μg/L)[20];其中质量浓度最高的单体是BBOEP,平均为5.01 μg/L,其次是DnBP(3.81 μg/L),最低的是BCEP,质量浓度范围是0.48～0.53 μg/L,平均质量浓度是0.52 μg/L。在加拿大当地志愿者的尿液中,BBOEP几乎检测不到,BCEP质量浓度最高(ND～12.33 μg/L), DnBP质量浓度最低,最大质量浓度为0.28 μg/L[29]。而孕妇尿液中,DPhP是最丰富的OPEs代谢物,质量浓度为0.13～25.2 μg/L[21]。在另一项类似的研究[25]中,也发现了较高水平的DPhP(37.0 μg/L)。

表 5 实际尿样中7种OPEs代谢物和8-OHdG的质量浓度

* Significant atp<0.05 level; ** significant atp<0.01 level.

图 7 实际尿样的总离子流图Fig. 7 Total ion chromatogram of real urine sample

如表6所示，7种OPEs代谢物和8-OHdG的相关性分析结果表明:DnBP、BCEP、BCPP、BDCPP、7种OPEs代谢物总量和8-OHdG两两之间显著相关,说明已暴露的OPEs浓度水平可能导致DNA损伤,从而影响人体氧化损伤产物8-OHdG的产生,OPEs体内暴露水平和氧化损伤的联系有待进一步研究。

3 结论

本文建立了自制混合型小柱-高效液相色谱-串联质谱同时检测人体尿液中7种OPEs代谢物及DNA损伤生物标志物8-OHdG的分析方法。该方法操作简单,灵敏高效,适用于人体尿液中OPEs代谢产物及8-OHdG同时定性、定量检测,为更全面评价OPEs暴露水平及机体损伤等提供了研究基础。