生物样品中大田软海绵酸类毒素代谢规律及检测方法的研究进展

吕 莹,周志刚,陈 思,张小军

(1. 浙江海洋大学水产学院, 浙江 舟山 316022; 2. 浙江省海洋水产研究所水产品加工与质量安全研究室,浙江 舟山 316021; 3. 舟山市公安司法鉴定中心, 浙江 舟山 316021; 4. 浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室, 农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站, 浙江 舟山 316021)

赤潮是中国近海四大主要自然灾害之一。近几年,中国贝类毒素污染日趋常态化和普遍化,且已造成多次重大突发性中毒事件。现有腹泻性贝类毒素(DSP)中以大田软海绵酸(OA)及其衍生物鳍藻毒素(DTXs)分布最广、危害最大[1,2]。DSP中毒事件的早期诊断主要通过判断患者的中毒症状,以及分析造成中毒事件的食物样品来完成。临床研究表明,OA类毒素能在肠道等组织内长期痕量蓄积,并主要以原型通过尿、粪排出体外。因此,在食物样品缺乏的案例中,建立体液中OA类毒素残留的检测方法对辅助诊断患者的中毒情况极为必要。现有关于DSP检测方法多针对贝类组织、水体、藻类等基质建立,鲜见对各种生物体液样品的应用分析。因此,本文综述了OA类毒素的理化性质、中毒事件、毒理作用、体内代谢规律,及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)在生物体液样品中的应用进展,以期为科学开展相关研究提供背景资料和参考依据。

图 1 大田软海绵酸及其衍生物鳍藻毒素的化学结构Fig. 1 Chemical structures of okadaic acid (OA) and dinophysistoxins (DTXs)

1 大田软海绵酸类毒素

1.1 理化性质

腹泻性贝类毒素由鳍藻属(Dinophysisspp.)和原甲藻属(Prorocentrumspp.)的部分藻类产生,为脂溶性聚醚或大环内酯化合物[1]。依据其碳骨架结构不同,可将DSP分为3类,其中酸性成分OA及其衍生物DTXs是DSP的主要活性成分,也是分布最广、危害最大的一类毒素[2]。在有毒藻及贝类中,OA类毒素主要以游离态和酯化态存在,游离态包括OA及其甲基化衍生物DTX-1和同分异构体DTX-2,这些毒素在贝类体内经酰基化、水解等生物转化过程又形成了酯化态产物DTX-3族。OA类毒素的基本结构由38个碳骨架组成,含有17个手性中心和3个螺环缩酮前体基团(见图1),不溶于水,溶于甲醇、正己烷等有机试剂,热稳定性高[3]。

1.2 中毒事件

统计国内外相关报道[4-22]发现,近50年来,DSP曾造成超过2.5万人中毒(见表1),这些中毒事件多由误食OA类毒素污染的贻贝、扇贝等引起。1961年,荷兰首次出现人类中毒事件后[4], DSP中毒事件在全球范围内陆续均有报道,以欧洲、日本爆发最为频繁。患者的临床症状包括腹泻(92%)、恶心(80%)、呕吐(79%)、腹痛(53%)等,一般可在2～3 d康复[5]。DSP中毒症状与肠胃道疾病症状极为相似,容易被人们忽视,其实际发生率可能远高于报道数据。

表 1 关于DSP人类中毒事件的报道案例

1.3 毒理作用

丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶参与调节细胞的基本生理过程,OA类毒素能特异性地抑制该酶的活性[23],导致大量蛋白质去磷酸化并积聚,从而产生多种毒理作用[24,25]。OA类毒素以肠道为靶器官,刺激细胞内环磷酸腺苷(cAMP)介质系统,依赖cAMP的蛋白激酶随着cAMP的升高而被激活,蛋白质磷酸化,细胞大量分泌水、氯及碳酸盐,抑制对钠的正常吸收,从而使患者产生急性水泻毒性[26]。虽然OA类毒素属于非致命贝类毒素,但却是强效的癌变促进剂和凋亡诱导因子[27]。研究表明,当消费者慢性或亚慢性暴露于OA及DTXs时可损伤肠黏膜,诱发胃肠道癌[28]。此外,OA还具有细胞毒性、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性、胚胎毒性等慢性毒性[29]。目前,欧盟规定贝类产品中DSP限量标准为160 μg/kg(OA当量)[30],欧洲食品安全局(EFSA)在新的毒理学数据基础上,重新对OA和DTXs限量标准进行了评估,并建议将其修订为45 μg/kg(OA当量)[31]。

2 大田软海绵酸类毒素的体内代谢规律

关于OA类毒素的体内毒理学实验多以小鼠、大鼠为实验动物,通过口服、灌胃、腹腔注射进行[25]。一般来说,腹腔注射对实验动物的毒性最强,其次为灌胃,口服最弱。

据文献报道,OA对小鼠的口服、灌胃和腹腔注射半数致死量(LD50)分别为192～880[32,33]、760[34]和186～225[35-37]μg/(kg·bw); DTX-1对小鼠灌胃和腹腔注射的LD50分别为487 μg/(kg·bw)[34]和150 μg/(kg·bw)[37]; DTX-2对小鼠灌胃和腹腔注射的LD50分别为2 262 μg/(kg·bw)[34]和352 μg/(kg·bw)[35]。

Matias等[37]以液相色谱-荧光分析法(LC-FLD)为检测手段,系统研究了经单次灌胃50 μg/(kg·bw)氚标记的OA([3H]OA)24 h时小鼠各器官中的毒素代谢情况。结果发现,肠道内容物中[3H]OA的蓄积量占总量的36.3%,尿、皮、粪和血次之,分别为11.6%、8.3%、6.6%和4.3%,其他组织均低于1%;单次灌胃50 μg/(kg·bw)和90 μg/(kg·bw) [3H]OA剂量下,24 h小鼠血液毒素的质量浓度分别为23 ng/mL和27 ng/mL,尿液毒素的质量浓度分别为151 ng/mL和246 ng/mL[37]。Fujiki和Suganuma等[38]比较了口服和腹腔注射[3H]OA时,小鼠对毒素的代谢情况。研究显示,口服3 h后77%的[3H]OA蓄积于小鼠胃肠道内容物中,19 h后4%和30%的[3H]OA分别蓄积于小鼠胃肠道内容物和粪便中,肝脏中[3H]OA蓄积量始终仅为1%;而腹腔注射3 h后小鼠胃肠道内容物和肝脏中[3H]OA蓄积量分别占总量的33%和27%, 19 h后二者分别降低至5%和16%[38]。由此推断,小鼠口服OA后毒素多由肠胃吸收或通过肠肝循环代谢,并以原型代谢,经尿、粪排出体外;而腹腔注射OA后毒素则通过肝胆循环排出。

Ito等[32]利用免疫染色法研究了口服75～250 μg/(kg·bw) OA的小鼠在5 min～12 w期间的毒素蓄积和清除情况。口服150 μg/(kg·bw) OA剂量(3/8致死量)后,小鼠肺、小肠和胃的损伤分别持续10 min～8 h、45 min～4 h和60 min～16 h,盲肠、大肠的损伤则分别持续2～4 h、2 h～4 d;胃和小肠上部毒素残留均达24 h,盲肠毒素残留达16 h,心、肺、肝、大肠、肾及盲肠内容物中毒素残留长达2 w,大、小肠内容物毒素残留长达4 w[32]。

Vieira等[39]利用液相色谱-串联质谱法为检测手段,分析了小鼠经口服500～1 000 μg/(kg·bw) OA后的毒素代谢规律。口服700 μg/(kg·bw) OA 1 h后,小鼠粪便和血液中毒素残留分别为30～106 ng和66～160 ng/mL;而口服1 000 μg/(kg·bw) OA,小鼠粪便和血液中毒素残留分别为67～115 ng和128～336 ng/mL[39]。Abal等[34]采用同一手段分析小鼠经灌胃500～1 000 μg/(kg·bw) OA或250～1 000 μg/(kg·bw) DTX-1 24 h内粪便、尿液和血液毒素的代谢规律。毒代动力学数据显示,无论是粪便还是尿液的排泄量,OA剂量组均显著高于DTX-1剂量组;DTX-1最低剂量组(250 μg/(kg·bw))小鼠尿液中毒素在灌胃6 h排泄最快,9～24 h持续且缓慢排泄。OA和DTX-1均主要通过粪便排出体外,粪便样品中OA的残留量与灌胃剂量呈显著相关性,且次高剂量组(875 μg/(kg·bw) OA)粪便样本在12 h时残留量达到最大值,而粪便样品中DTX-1的残留量与灌胃剂量不具显著相关性[33]。该研究说明小鼠对OA和DTX-1的代谢及排泄规律存在显著差异,DTX-1肠吸收率要高于OA毒素。

3 生物样品中大OA类毒素的检测研究

毒理学研究及临床案例均发现,OA类毒素能在肠道等组织内长期痕量蓄积,且经人体吸收后主要以原型通过尿、粪排出[32,34,37,39,40]。食物中毒事件调查往往通过收集并检测中毒食品来确定致病因素和治疗措施,而在食物样品缺乏的情况下,利用仪器分析技术确证跟踪病人体液(如血液、尿液、唾液等)中毒素的残留水平则可达到辅助诊断中毒病因的作用。现有检测方法,如生物检测法(小鼠生物法、细胞检测法)、色谱分析法(LC-FLD、LC-MS/MS)、生化测试法(免疫分析法、酶活力分析法)多针对贝类组织、水体、藻类等基质建立,鲜见对各种生物体液样品的应用分析。

表 2 LC-MS/MS测定生物体液样品中水产生物毒素的文献报道

TTX: tetrodotoxin; STX: saxitoxin; NEO: neosaxitoxin; DA: domoic acid; MC: microcystin; MeOH: methanol; ACN: acetonitrile; AA: acetic acid; SCX: strong citation exchange; CBA: carboxyl bonded amide; PCX: polymer citation exchange; PA: polyamide; WCX: weak citation exchange; CCX: carboxyl citation exchange; PAX: polymer anion exchange; -: not mentioned.

血液、尿液等生物样品组成复杂,基体干扰大,对分析方法的选择性要求更高;而OA类毒素在生物介质中的质量浓度通常低至ng/mL水平,需要采用高灵敏的检测技术。目前的研究者已从样品前处理和检测技术两方面着手,建立了体液样品中多种水产生物毒素的定量分析方法,其中以LC-MS/MS最为普遍。表2概括了近年来血、尿、粪样品中腹泻性贝类毒素、河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)、麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poison, PSP)、记忆缺失性贝类毒素(amnesic shellfish poison, ASP)及蓝藻毒素(cyanobacterial toxin, CTX)的LC-MS/MS检测方法。

在LC-MS/MS定量分析前,必须对生物样品进行前处理,去除会干扰结果的物质,提高检测的准确度。其中,最常用的前处理方法是蛋白质沉淀法,通过添加表面活性剂(三氯乙酸、甲酸等)或二者结合使用,使蛋白质变性析出。Abal等[34]就通过在血液、尿液等样品中加入乙腈、甲醇等有机溶剂达到沉淀蛋白质的目的,结合离心、过滤等简单的方法完成样品的预处理,同时应用LC-MS/MS研究了OA和DTX-1两种毒素在小鼠体内的代谢过程。

蛋白质沉淀法虽然操作简单,成本低,但净化效果较差,基质效应显著。对于内源性干扰大的复杂样品,往往选用蛋白质沉淀和固相萃取(SPE)联用进行前处理。SPE利用固相填料对被测毒素与基质组分的不同吸附作用,通过选择合适的溶剂进行洗脱,从而实现对目标物的分离、纯化和富集。根据相似相溶机理可分为正相SPE、反相SPE、离子交换SPE和吸附SPE;根据其萃取阶段又可分为在线SPE和离线SPE。Wang等[40]用甲醇处理尿液中的蛋白质后取上清液,过反相C18固相萃取柱富集,再用甲醇洗脱,洗脱液在浓缩、复溶后经LC-MS/MS分析,OA、DTX-1和DTX-2 3种毒素的检出限为0.5～0.7 ng/mL。

当单一萃取手段无法达到有效的纯化和富集时,多维萃取模式是解决这一问题的有效途径。已有研究应用双SPE柱固相萃取的前处理技术,建立了尿液、血浆等生物样品中河豚毒素的LC-MS/MS检测法[43]。样品用2%乙酸稀释酸化,加入经甲醇活化和水洗除杂后的Supelco C18固相萃取柱进行处理后,再采用SeQuant HILIC固相萃取柱纯化河豚毒素,可有效消除生物基质对质谱的离子抑制效应[43]。

在线样品处理技术通过六通阀将SPE柱与LC-MS/MS连接起来,显著简化了样品的处理过程,可实现生物样品的高通量处理,已成为了毒物分析领域的研究热点。Hamelin团队[42,46]已先后建立了尿液中麻痹性贝类毒素、河豚毒素的在线SPE柱固相萃取-LC-MS/MS检测法,单个样品的前处理时间可控制在1 h内。基于在线固相萃取-LC-MS/MS技术的生物样品自动化分析,若能与双柱,甚至多柱交替萃取模式结合,更可显著提高毒理学评价和临床诊断的效率。

4 结论

近年来,与有毒鳍藻、原甲藻伴生的贝类毒素污染事件多发。消费者一旦误食OA类毒素污染的贝类产品,其急性中毒症状与肠胃道疾病症状极为相似;慢性暴露于该类毒素还会诱发癌变和各种慢性毒性;对中国的近海消费者的食用安全构成威胁。毒理学研究及临床案例显示,OA类毒素经人体吸收后主要以原型通过尿、粪排出。尿液样品简单易得、收集量大、毒素残留浓度相对较高,在缺乏中毒食品的情况下,利用仪器分析技术确证跟踪其中OA类毒素的残留水平可达到辅助诊断中毒病因的作用。大量应用实例证明LC-MS/MS在复杂生物体液样品中水产生物毒素分析中的优势,已有学者采用有机试剂去除蛋白质、C18 SPE柱富集等前处理成功建立了血、尿、粪样品中OA类毒素的检测方法。双SPE柱、甚至多SPE柱交替萃取可显著提高样品的净化效果,在线固相萃取系统将实现样品的快速化和高通量化,均亟须进一步的研发和应用。