啤酒酵母絮凝影响因素及改善途径的研究概况

崔云前，袭祥雨，吉春晖，杜俊杰

齐鲁工业大学生物工程学院，山东省微生物工程重点实验室（济南 250353）

酵母絮凝是啤酒酵母的一项重要特性，对于酿造啤酒具有极其重要意义。1976年，法国的Louis Pasteur在研究啤酒酵母时发现其存在这方面性状[1]。酵母絮凝是酵母细胞在发酵液中由发散的悬浮状态聚集成团然后快速沉降的一种现象。絮凝是啤酒发酵过程中酵母细胞大量沉淀的前提条件，因此絮凝特性的改变通常意味着沉淀现象的变化。在发酵过程中，絮凝时机非常重要。在麦汁发酵完全之前，不应过早发生絮凝，因为过早絮凝会导致发酵迟缓或停滞，最终的啤酒含有高残留糖和令人不满意的风味特征。相反，啤酒发酵快结束时，大量酵母细胞凝聚，结团后沉降过程有助于发酵液澄清。啤酒酵母菌种类不同，生理特性不同，因而絮凝性存在巨大差异。

1 絮凝的机理

国内外对于啤酒酵母絮凝性的研究有数百年历史，但对于啤酒酵母絮凝机理的复杂性，还没有得出准确定论。根据对已有研究的总结，啤酒酵母絮凝的机理主要有几种假说。

1.1 钙桥假说

Ca2+存在时，相邻的酵母细胞间通过细胞外壁的羧基与之相连，形成细胞的空间网状结构，从而絮凝沉降下来[2]。这个假说没能解释清楚絮凝过程中出现糖抑制现象和细胞间特异性相互作用。

1.2 外源絮凝素假说

有些酵母细胞表面带有絮凝素，贴近细胞壁并且选择性地结合相邻酵母细胞壁上的甘露糖残基，Ca2+在其中起到激活絮凝素作用。发酵液中的游离甘露糖占据絮凝素结合位点时，絮凝素便不能再与细胞壁上的甘露糖残基相结合。有些不含有絮凝素的酵母也能发生絮凝现象，原因是其含有与絮凝素结构相似的絮凝剂[3]。只在絮凝性酵母上发现过絮凝供体，且该物质对蛋白酶敏感；絮凝受体在絮凝性酵母及非絮凝性酵母上都存在，对蛋白酶不敏感，且受甘露糖的专一性抑制。絮凝性酵母和非絮凝性酵母都可以合成絮凝素，两者差别在于絮凝性酵母在其生长过程中可以连续合成并释放絮凝素，而非絮凝性酵母则不具备这一特性[4]。因此，酵母的絮凝性取决于絮凝素能否被释放。

1.3 基因调控假说

酵母细胞的絮凝基因是FLO1、FLO2、FLO4、FLO11和Lg-FLO1，此外FLO5、FLO9基因与FLO1基因具有高度同源性，它们表达的絮凝素也会使得酿酒酵母发生絮凝现象[5]。其中，FLO1、FLO5、FLO9基因控制细胞与细胞间具有相互黏附作用，使Lg-FLO1基因编码絮凝素与甘露聚糖结合。絮凝基因活跃表达时会产生絮凝素，从而导致酵母发生絮凝现象。但是由于调节絮凝的基因家族数量较多，且十分不稳定，每一个基因都具有复杂的调节机制，并且受外界环境的影响比较大。不同种类的酵母絮凝基因的不稳定和差异等因素都会造成絮凝困难。

2 影响酵母絮凝性的因素

2.1 麦芽及麦汁组成

麦芽中含有酵母超前絮凝（PYF）因子，可以造成酵母提前絮凝。麦芽的PYF因子对啤酒酵母的絮凝性影响较大，PYF因子活力越低，酵母絮凝性越小，反之PYF因子活力越高，酵母絮凝性越强[6]。PYF因子大小受大麦品种、品质、制麦等过程中微生物污染的影响。Jibiki等[7]认为在制麦前对大麦进行清洗，有助于减缓PYF因子对酵母絮凝的影响，因为多数PYF因子附着在大麦表面且溶于水，提前絮凝会造成麦汁中糖的降解速度减慢，利用率降低，发酵不彻底。

麦汁中的糖为酵母提供营养物质，这些成分缺乏时，会使得酵母细胞表面的疏水性增强，进而诱导酵母细胞发生絮凝现象。周波等[8]研究表明，麦汁浓度越高，酵母细胞就越难凝聚，尤其是在含高浓度葡萄糖的麦汁中，酵母不易絮凝；但在含高浓度麦芽糖的麦汁中，酵母絮凝容易絮凝。葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖均可抑制酵母絮凝，且三者之中葡萄糖抑制作用最低。

麦汁中的氨基酸可为酵母生长繁殖提供氮源，因而对酵母絮凝有重要作用。麦汁中氨基酸含量不足时，酵母繁殖缺乏充足的可同化氮，繁殖速度会降低，新生细胞数目减少，从而导致酵母絮凝速度降低[9]。大米等辅料的存在，使得麦汁中可同化氮数量减少，也会从不同程度上减缓絮凝速度。

麦汁中金属离子含量对酵母絮凝也有重要影响，特别是Ca2+浓度的大小对酵母絮凝性影响十分显著[10]。Ca2+与细胞表面的羧基基团相互作用可以产生“钙桥效应”，有利于酵母絮凝。它还是酵母健康生长必需的矿物质元素之一，是参加酵母代谢活动所必需的，它虽然不直接参与酵母细胞的物质组成，但是能以离子状态控制细胞生理状态[11]。另外Ca2+还会受其他同系物的竞争性抑制。此外，除了Ca2+外，Zn2+、Mg2+也可促进酵母絮凝作用，但Ba2+、Pb2+、Na+、K+会抑制酵母的絮凝作用[28]，这些金属离子对酵母絮凝的影响机制有待进一步研究。

由于酵母是兼性厌氧微生物，所以在有氧和无氧的环境下都能生存。麦汁中溶解氧含量不足时，新生健壮的酵母细胞数量减少，衰老、死亡的酵母细胞数量增多，从而使得酵母细胞的增殖率下降[12]，最终导致酵母过早但不完全絮凝；溶解氧含量过多时，酵母增殖速度加快，加快发酵速度，影响酵母细胞的正常代谢，加快细胞衰老或死亡速率，使得酵母提前絮凝。酵母在缺氧的培养基中的不良生长和絮凝现象，可以通过向培养基中添加多角甾醇和油酸使之发生改变，这表明氧气通过影响不饱和脂肪和固醇的合成作用从而间接地影响酵母的絮凝[5]。因此，麦汁中适量的氧含量对于酵母絮凝性具有重要作用。

2.2 酵母

絮凝现象是酵母本身固有的一种特性，不同类型酵母细胞之间遗传基因、细胞结构等均存在差异，因此导致不同种类的酵母之间絮凝性不同。一般情况下，母细胞比新生酵母细胞更容易发生絮凝。这是因为母细胞可以产生絮凝素，并且在母细胞繁殖几代之后，细胞表面褶皱增多，更容易发生凝聚现象[13-17]。新生细胞生长繁殖活力旺盛，不易絮凝。

Speers等[18]研究表明，絮凝开始时酵母细胞表面疏水性（CSH）和表面电荷发生变化，即在絮凝开始时，细胞表面疏水性增加、电荷减少。据报道，随着细胞到达指数生长期，细胞表面的疏水性迅速增加，并在酵母细胞的稳定期达到较高的稳定水平[19]。指数生长期的子细胞较小，因而细胞表面疏水性低，这些子细胞的疏水性明显低于老细胞[20]。细胞表面疏水性在保持絮凝分子的正确构象方面起重要作用[21]，使稳定期的絮凝分子更加有活力。与拉格酵母细胞相比，艾尔酵母细胞具有更系统的疏水性，且负电荷少[22]。除了有助于形成絮凝物之外，艾尔酵母细胞疏水性更大的现象可能解释了为什么在传统的啤酒发酵过程中啤酒菌株的絮凝物与CO2气泡有关，并上升到啤酒表面，而拉格酵母菌株的絮凝物则下沉到底部[23]。在许多现代酿酒厂，艾尔酵母菌株也沉入大型圆锥形发酵容器（CCV）的发酵底部。在大型圆锥形发酵罐中，较大的静水压力可能会限制附着在酵母絮凝物上CO2气泡的大小，增加的湍流可能会使CO2气泡从絮凝物上分离，但也可能有意或无意选择艾尔酵母细胞的沉淀突变体，以便于从底部进行回收。

在啤酒酿造过程中，掌握好酵母添加量对于保持酵母菌种的优良性状和保持啤酒发酵的顺利进行至关重要。添加过多酵母，会使得麦汁中α-氮被迅速同化，导致酵母在发酵后期缺乏充足的营养物质，造成降糖和还原双乙酰困难，影响酵母细胞的絮凝性；添加过少的酵母，会使得起发慢，pH下降速度减慢，形成大量高级醇，且发酵液容易感染杂菌，造成酵母絮凝性变差。

在酵母细胞的传代过程中絮凝性会发生变化。一般来说，前几代酵母往往絮凝性弱于高代酵母，但是过高的代数又会导致酵母絮凝性降低。有研究表明，酵母传代增加酵母絮凝性的因素有2个：（1）酵母细胞的使用代数增加，改变酵母细胞壁的某些功能；（2）酵母细胞在传代过程中基因突变频率高，从而导致絮凝的FLO1、FLO5、Lg-FLO1基因的突变频率增加，导致絮凝概率增加[24]。

酵母在发酵罐中要遵循一定的沉降规律，因此回收酵母时，要按照“掐头去尾取中间”原则。先沉降下来的多为衰老或死亡的活性较差的酵母细胞，还混有大量冷凝固物及沉渣杂质，絮凝性较差；中层为发酵指数期的酵母，活力和发酵能力最强，凝聚性较好；上层大多数是轻质酵母，主要由落下的泡盖和最后沉降下来的酵母细胞组成，活性差，沉降后其中混有蛋白质、酒花树脂等析出物和杂质，絮凝性不及中层酵母[25]。

此外，酵母的共絮凝也会影响絮凝现象。Stewart等[26]研究表明，Labatt啤酒厂艾尔酵母是两种酵母的混合物，单独在麦汁中培养时，这2种酵母是非絮凝状的，但这2种酵母在接种数量相等的麦汁中，发酵结束时酵母絮凝效果良好。因此，共絮凝可以促进絮凝现象发生。

2.3 理化指标

pH能改变酵母细胞表面的带电状态，从而影响酵母细胞之间相互碰撞概率，增加氢离子浓度可以降低细胞表面所带电荷。pH越接近酵母细胞表面的蛋白质等电点，越有利于絮凝现象的发生[27]。因此发酵液pH 4.2～4.7时，酵母絮凝性最好。

温度也是影响酵母絮凝性的重要因素。发酵液中温度过低时，酵母繁殖速度慢，起发延缓，发酵液容易感染细菌；温度过高时，酵母繁殖速度快，加快菌种退化速度，易造成酵母衰老、死亡，絮凝性高。对于不同的酵母的最适温度有所不同，因此，对于酵母絮凝的最佳温度并没有确定的说法。

2.4 其他物质

Jin等[29]研究表明，增加酒精体积分数能够提高细胞表面疏水性，使絮凝速度增加。在一定程度上，乙醇是有机溶剂，可溶于水，能改变溶液介电常数，局部介电常数的改变会降低细胞间电荷排斥力，暴露细胞表面疏水位点，增加细胞间相互作用，促进酵母的絮凝作用[30]。但是单连菊等[31]研究表明，酒精含量在2%以下时，絮凝性变化不大。超过这个范围后，随着酒精含量升高，酵母絮凝性明显减弱。

高浓度的尿素是一种蛋白质变性剂，可以直接作用于蛋白质分子，减少细胞间相互疏水作用，改变氢键稳定性，通常用于检测蛋白质可逆展开构象稳定性[30]。尿素对絮凝现象的抑制作用是暂时的，去除后可恢复絮凝能力。这一现象说明尿素通过可逆反应改变酶絮凝素分子构象，可使酵母丧失絮凝能力。但是，酵母细胞在高浓度尿素的缓冲液中过夜后，酶絮凝素分子发生变性，不能再恢复其原有絮凝能力[7]。

甲基-α-D-吡喃甘露糖苷（α-MMP）是甘露糖的疏水性衍生物。α-MMP可与酵母甘露聚糖的末端甘露聚糖残基竞争酶絮凝素受体，抑制酵母絮凝素的疏水性而对酵母絮凝产生抑制作用[30]。

2.5 微生物污染

啤酒酿造过程中的杂菌主要有乳酸菌、野生酵母，其中感染野生酵母会使得菌种退化、死亡甚至出现自溶现象，造成酵母提前絮凝，而乳酸菌会引起啤酒酵母的异常絮凝。微生物污染会使啤酒中带有不良风味，通过严格控制酿造过程的生理卫生条件可防治微生物污染。

3 酵母絮凝对啤酒品质和风味的影响

在啤酒的工业生产活动中，啤酒酵母在发酵结束时絮凝有利于酵母的回收和发酵液的澄清过程。但是正常生产实践中存在2种不正常絮凝现象：在发酵液未发酵完全时提前絮凝；发酵结束后酵母不絮凝。不论是哪种情况发生，都会影响啤酒品质和风味。

首先，絮凝会影响啤酒酵母的回收和再利用过程。絮凝性差的酵母往往会悬浮在发酵液当中，沉降速度慢，不利于酵母的回收和再次利用。酵母长时间悬浮在发酵液中易发生自溶和突变现象，自溶现象使得成品啤酒中带有酵母味，口感变差；突变现象则会使酵母细胞向不确定的方向发生变异，使啤酒的稳定性变差。而且回收后的酵母活力变差，下次使用时易引起发酵不完全等现象。

其次，絮凝性强的酵母可能会在发酵完成前凝集成团而后悬浮于发酵液顶部或沉降于发酵液底部，使得发酵液中悬浮酵母细胞数量减少，减缓发酵速度；将可发酵糖转化成乙醇能力降低，发酵度较低；双乙酰的还原速度较慢，延长工艺生产时间。絮凝性差的酵母在经过低温储存后仍有大部分酵母细胞悬浮在啤酒中，易造成酒体浑浊、清酒过滤困难，增加分离酵母时所耗能源，增加啤酒损失[32]。

此外，絮凝性不同的酵母所酿造的啤酒中高级醇、挥发酯等风味物质的形成量和组成成分均存在显著性差异，从而影响啤酒风味。絮凝性过强的酵母会提前絮凝，使酵母降糖不完全，双乙酰还原不完全，发酵度低，啤酒口感偏甜[33]；絮凝性差的酵母易悬浮在发酵液中产生自溶现象，在啤酒中产生自溶味、酵母味或者老化味，使啤酒风味变差。

4 改善酵母絮凝性的途径

选用品质优良的大麦原料[34]；保证麦汁中Ca2+浓度控制在合理范围内，建议酿造水中Ca2+浓度控制在100×10-6mol/L左右，麦汁中Ca2+合理浓度范围。在60×10-6～100×10-6mol/L，啤酒中Ca2+合理浓度范围在25×10-6～50×10-6mol/L[35]；保持麦汁中充足的麦芽糖、葡萄糖含量及α-N含量，使其在最适范围内；通过流量计稳定控制麦汁充氧量6～10 mg/L[36]；制麦过程是控制PYF因子的重要环节，因为此阶段大麦发芽所需的水分、温度和空气等，恰好为微生物的生长繁殖提供良好条件[37]。用基因工程手段改善酵母的絮凝性，培育絮凝性良好的酵母菌株[38]；采用10 ℃低温进行纯种酵母扩培，有利于增加零代酵母的絮凝性。采用25 ℃高温进行纯种酵母扩培，在培养的麦汁中添加锌离子进行酵母扩培，可使零代酵母具有较好絮凝性[39]；发酵过程用温控装备保持温度恒定，防止忽高忽低；生产过程中不使用杂菌污染的原料、酵母和酿造水等。定期清洗发酵装置，防止产生杂菌污染。

5 展望

酵母絮凝是影响啤酒风味和品质的重要因素之一，引起国内外各大啤酒厂广泛关注。但在实际生产中，酵母絮凝性往往会同时受麦芽及麦汁组成、酵母、理化指标等多种因素共同影响，因此对影响酵母絮凝性因素相互作用机理的进一步研究，是未来发展方向，期望在工业生产中酵母絮凝得到更好控制。