正交法探究几种因素对啤酒酵母发酵PYF现象的影响

张朝武

摘 要：经查阅大量技术文献发现，目前国内外报道的影响啤酒酵母发酵PYF现象的主要因素有制麦工艺、微生物代谢产物、酵母菌种特性、麦芽汁的营养成分组成、发酵工艺参数等。本实验采用的单因素试验中选取和探究了啤酒麦芽浸麦温度、浸麦二氧化碳含量、啤酒原料麦芽表面的霉菌数量、麦汁煮沸时锌离子添加量这4个因素对啤酒酵母发酵PYF现象的影响，正交试验结果表明：浸麦二氧化碳含量>麦芽霉菌数量>浸麦温度>硫酸锌添加量。

关键词：啤酒发酵  啤酒酵母  酵母PYF  正交实验

啤酒酵母发酵PYF（Premature Yeast Flocculation）现象，即啤酒酵母在发酵过程中提前絮凝沉降使啤酒发酵液中的酵母数减少，造成发酵液降糖速度降低、发酵周期延长、啤酒中双乙酰和乙醛等风味物质含量偏高，进而导致啤酒的发酵过程失败及可饮性下降。因此，啤酒酵母发酵PYF现象是啤酒酿造过程中一个非常关键的技术指标。近年来，国内外诸多啤酒专家和学者研究并报道了啤酒酵母发酵PYF现象的进展和成果，但较为偏重于理论层面的研究，对啤酒工业实际生产的指导意义有限。

目前，已报道的影响啤酒酵母发酵PYF现象的主要因素包括制麦工艺、微生物代谢产物、酵母菌种特性、麦芽汁的营养成分组成、发酵工艺参数等。本实验设计探究了麦芽表面的霉菌数量、浸麦二氧化碳含量、麦汁煮沸锌离子添加量、浸麦温度这4个因素对啤酒酵母发酵PYF现象的影响，同时使用正交实验探究最佳的因素组合与各个因素的影响大小次序。

1 实验设备、原材料和方法

1.1 实验设备

台秤、EBC标准麦芽粉碎机、啤酒糖化仪、定量快速滤纸、烧瓶、电磁炉、恒温水浴摇床、250mL的Schott玻璃瓶若干、移液枪、电子显微镜、血球细胞计数板、盖玻片、酵母计数器、蜗旋振荡器。

1.2 实验原料

实验设计要求的试验啤酒麦芽、城市自来水、斜面酵母菌种、无菌蒸馏水。

1.3 实验方法

1.3.1 啤酒麦芽的粉碎

按实验设定的要求将不同的啤酒麦芽用EBC标准啤酒麦芽粉碎机粉碎，取5个糖化杯，每个糖化杯用实验室台秤准确称量100g麦芽粉。

1.3.2 啤酒协定麦汁的制备

设定糖化仪的温度曲线为：48℃休止40分钟，63℃休止30分钟，72℃休止30分钟，85℃休止5分钟。将45℃的自来水分别投入5个装有麦芽粉的糖化杯中，每个糖化杯加入300g水，然后搅拌均匀，放入糖化仪中进行糖化。糖化结束后，用定量快速滤纸过滤糖化的醪液，得到澄清的麦芽汁，之后向麦芽汁中加入少量自来水将麦芽汁的Plato糖度调整为11°。取250mL的Schott玻璃瓶若干，准确称量Plato糖度为11°的麦芽汁200g分别加入Schott瓶中，拧紧瓶盖，放入沸水中杀菌60分钟后取出放入15℃的水浴锅中保温备用。

1.3.3 酵母的接种

从冰箱冷藏室中取出试管斜面培养的啤酒酵母，用接种针取一定数量的酵母放入50mL无菌塑料试管中，加入50mL无菌蒸馏水后盖上试管盖子，在蜗旋振荡器上振荡3分钟，酵母在无菌蒸馏水中均匀分散后使用5mL移液枪迅速移取5mL酵母水溶液到上述装有15℃麦芽汁的Schott玻璃瓶中并拧紧瓶盖。

1.3.4 麦汁的充氧和发酵

将上述Schott玻璃瓶雙臂交叉摇晃振荡60次，且每20次打开瓶盖充氧5秒，然后拧紧瓶盖继续摇晃振荡。之后，将充氧和摇匀的发酵液放到15℃恒温水浴摇床中发酵。

1.3.5 酵母的计数和PYF数值计算

发酵48小时后取出玻璃瓶，打开瓶盖，用移液枪移取少量发酵液到血球计数板上，盖上盖玻片，然后用电子显微镜读出酵母数。此时，将实验样酵母数除以标准样酵母数即为实验样的PYF数值。

2 结果与分析

2.1 啤酒酵母发酵PYF现象的单因素实验

2.1.1 啤酒麦芽表面的霉菌数量对于PYF现象的影响

麦芽表面的霉菌会在特殊的应激环境下分泌霉菌毒素等初级和次级代谢产物，这些代谢产物会影响啤酒酵母发酵PYF现象。实验室做了5组试验，得到如下数据：霉菌为3200个/g时，PYF为67%;霉菌为4400个/g时，PYF为70%;霉菌为7100个/g时，PYF为71%;霉菌为25000个/g时，PYF为97%;霉菌为3900个/g时，PYF为92%。通过实验数据可知，在霉菌菌落数为25000个/g时，得到的PYF数据最大峰值为97%，是较为理想的数据。因此，选择霉菌数量为20000个/g、25000个/g、30000个/g进行正交实验设计。

2.1.2 制麦时浸麦温度对于PYF现象的影响

制麦过程中，当大麦发芽时如外界环境发生变化会使种子产生应激反应，进而生成一些特殊的复杂成分，从而影响后期的酵母发酵过程。使用实验室微型制麦机，通过调整浸麦温度得到不同的PYF数据：浸麦温度为7℃时，PYF为91%;浸麦温度为10℃时，PYF为100%;浸麦温度为15℃时，PYF为97%;浸麦温度为20℃时，PYF为94%;浸麦温度为25℃时，PYF为83%。由实验数据可知，在浸麦温度为10℃时，酵母发酵PYF为最高值100%，故选择浸麦温度8℃、10℃、12℃进行正交试验设计。

2.1.3 制麦时浸麦二氧化碳浓度对于PYF现象的影响

在实验室微型制麦车间中，通过测定干法浸麦期间开启或关闭鼓风机检测了浸麦层的二氧化碳含量，试验了不同干法浸麦时二氧化碳含量对于酵母发酵PYF现象的影响，试验数据为：二氧化碳含量为2000ppb时，PYF为103%;二氧化碳含量为5000ppb时，PYF为100%;二氧化碳含量为10000ppb时，PYF为98%;二氧化碳含量为20000ppb时，PYF为95%;二氧化碳含量为25000ppb时，PYF为92%。由试验数据可知，随着二氧化碳浓度的升高，PYF值越来越小，因此较低的二氧化碳浓度会减弱PYF现象，故选择二氧化碳含量为1500ppb、2000ppb、2500ppb进行正交试验设计。

2.1.4 啤酒麦汁煮沸时锌离子添加量对于PYF现象的影响

在啤酒糖化麦汁煮沸结束前5分钟加入酵母营养硫酸锌——适量添加锌离子对于酵母的发酵有益，但锌离子过多会导致酵母发酵机能减弱。本实验在实验室协定麦汁中添加硫酸锌0.25ppm、0.75ppm、1.25ppm、1.75ppm、2ppm，对应的PYF数据为83%、98%、97%、78%、65%。由数据可知，硫酸锌添加量为0.75ppm时得到的PYF数据比较理想，故选择硫酸锌添加量为0.50ppm、0.75ppm、1.00ppm进行正交试验设计。

2.2 啤酒酵母发酵PYF现象的正交实验设计

基于单因素的实验结果进行四因素三水平正交实验，设计L9（34）正交实验表，将正交实验结果的最优发酵组合与得分最高的一组进行最佳条件验证。

3 结论

根据目前国内外关于啤酒酵母发酵PYF现象的研究表明，其影响因素众多，但并没有研究能够明確表明影响因素的主次顺序。本实验选取4个单因素——浸麦层二氧化碳含量、麦芽表面的霉菌数量、浸麦温度与硫酸锌添加量进行探究，虽然它们未必是影响啤酒酵母发酵PYF现象的最主要或关键因素，但是通过单因素实验表明其对PYF的影响显著，因此可以用这4个因素来进行正交实验设计。

正交实验结果表明，对于啤酒酵母发酵PYF现象的影响程度的因素顺序为：二氧化碳含量>霉菌数量>浸麦温度>硫酸锌添加量。正交实验得到最优化的结果和组合为：霉菌数量25000个/g、浸麦温度10℃、二氧化碳含量2000ppb、硫酸锌添加量0.50ppm，对应PYF值为105%。

本实验采用的PYF检测分析方法是根据实际啤酒生产工艺开发的实验室方法，通过使用相同的实验设备和安排同一操作人员，可以在很大程度上消除试验数据的系统误差，故试验数据总体可信度较高。

通过本实验的研究表明，在实际的啤酒生产过程中，控制浸麦时二氧化碳含量和麦芽表面的霉菌数量非常重要，其可以在一定程度上改善啤酒酵母发酵PYF现象。

参考文献：

[1] （英）布里格斯，李崎，麦芽与制麦技术，中国轻工业出版社，2005年05月.

[2] 李秀婷，现代啤酒生产工艺，中国农业大学出版社，2013年6月1日.

[3] Steve Hindy，啤酒发酵与酯的形成+酒花与啤酒酿造+精酿啤酒酿造技术+酒花酵母麦芽水+啤酒酿造风味指南+菌种用水制麦+啤酒生产工艺配方大全书籍，中信出版集团，2019年8月.