啤酒酵母蛋白组学研究进展

郭　璇，栾　波，赵　雪，王　伟，李宪臻，俞志敏（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034）



啤酒酵母蛋白组学研究进展

郭璇，栾波，赵雪，王伟，李宪臻，俞志敏
（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034）

摘要：啤酒酵母是啤酒生产的重要发酵动力。啤酒酵母从未在自然界中分离得到过，而是通过酿酒酵母和其他菌株杂交得到，因此啤酒酵母具有不同于酿酒酵母的独特性质。随着基因组时代的到来，对于啤酒酵母的研究已由发酵性能逐步深入到组学研究，蛋白组学是组学研究的重要分支。蛋白组学能够研究细胞特定状态下所有蛋白质的特征与功能，目前将蛋白组学应用于啤酒酵母上，主要是以研究啤酒酵母亲本的起源与鉴定，不同生长和发酵阶段的蛋白变化以及环境胁迫条件下的蛋白表达。随着啤酒酵母蛋白组学的深入研究将对啤酒酵母的研究和啤酒品质的调控产生重要意义。

关键词：啤酒酵母；蛋白组学分析；研究进展

优先数字出版时间：2015-10-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151022.1508.006.html。

啤酒由于其独特风味和营养价值而备受人们青睐。啤酒酵母则是啤酒的灵魂，它的生物学特性直接决定了啤酒的风味与品质。因此许多啤酒厂及相关研究人员都对啤酒酵母的研究与调控十分重视。随着分子生物学技术的不断发展与进步，对于啤酒酵母的研究不只局限于传统发酵性能的检测与控制，而是向蛋白组学、转录组学、代谢组学等方面进行探索，力图从更深层面解读啤酒酵母的本质[1]。

蛋白组学是后基因组时代主要的研究任务之一，随着蛋白组学的快速发展，生命科学领域中的许多问题都能通过这个强有力的工具得到解决。蛋白组学技术可以同时测定样品中的成千上万种蛋白质，与基因组具有的普遍性和同源性相比，蛋白组学研究在特定的状态下细胞表达的所有蛋白质的含量、功能特征，并提供系统、全面的细胞动力学过程的信息，同时具有时间性、空间性、动态性和特异性等特征，能够更好地在细胞整体水平上对生命活动规律和本质进行阐述[2]。

针对于啤酒酵母蛋白组学，许多学者在已有酿酒酵母蛋白组学分析上，将两者的蛋白质进行比较，发现啤酒酵母独有的蛋白质及独特的功能，并研究不同条件下的蛋白质变化，从而为啤酒酵母的深入研究以及啤酒品质的调控起到指导性意义。本文简述了啤酒酵母和蛋白组学概念及相关技术，并介绍了蛋白组学在啤酒酵母研究上的进展，为今后的有关研究提供参考。

1啤酒酵母简述

1.1啤酒酵母来源

啤酒酵母（Saccharomyces pastorianus, syn.Saccharomyces carlsbergensis）是啤酒工艺的灵魂，决定了啤酒的质量[3-4]。啤酒酵母在自然界中从未分离得到过，而是通过酿酒酵母（S.cerevisiae）和另一个菌株杂交得到[5-6]。虽然啤酒酵母在亲缘性上与酿酒酵母接近，但两者的物质代谢特别是风味物质代谢上区别较大，而且“非酿酒酵母”（non-cerevisiae）部分的亲本是与啤酒风味相关的大部分基因的来源[7]。

1.2啤酒酵母分类

啤酒酵母大致上可分为上面酵母和下面酵母两类。上面酵母与酿酒酵母（S.cerevisiae）相似，用于生产爱尔啤酒（ale beer）。下面酵母又称拉格酵母（lager brewer’s yeast），用于发酵拉格啤酒（lager beer），目前市售啤酒大部分采用的都是拉格酵母[8]。

虽然许多爱尔啤酒酵母都是属于酿酒酵母[9]，但据最近研究显示，爱尔啤酒酵母（如来自特拉普啤酒）也包括酿酒酵母和Saccharomyces kudriavzevii的杂合子[10]。拉格酵母具有异源多倍体基因，亲本分别是S. cerevisiae 和Saccharomyces bayanus[5，11]，而适于麦汁低温发酵的特性很可能来自于bayanus亲本[12]。

1.3酵母基因组建立

1989年，酵母基因组计划正式启动，并于1996年完成了第一个真核生物的全基因组测序——酿酒酵母实验菌株S288c[13]。2009年，第1株啤酒酵母（Weihenstephan 34/70）的全基因组测序完成[6]，从而为啤酒酵母组学的研究提供了极大便利。

2蛋白组学概念及研究内容

2.1蛋白组学概念

1994年，蛋白质组（proteome）的概念首先由Marc Wilkins[1]等人定义为“基因组所表达的全部蛋白质，包括各种亚型及蛋白质修饰”。这个概念的提出标志着蛋白组学的诞生，其本质上是指在整体水平上对蛋白质的特征进行研究，包括蛋白质之间的相互作用及表达修饰等，进而得到蛋白质水平上的整体全面的认识。

2.2蛋白组学研究内容

蛋白组学的研究大致分为3个方面：（1）比较蛋白组学（comparative proteomics）：对人类重大疾病或重要生命过程进行研究，分析其病理/生理过程；（2）表达蛋白组学（compositional proteomics）：根据生物体或细胞/组织的基因组或转录组数据库，建立蛋白表达谱以及蛋白组连锁群；（3）蛋白质组学和生物信息学相互支撑结合的研究[1]。

3蛋白组学研究技术

3.1双向电泳质谱(2-DE-MS)技术

蛋白质双向电泳质谱（2-DE-MS）技术是一种操作方便、灵敏、应用最为广泛的蛋白质分离方法。双向电泳分离技术能够从复杂的样本中将蛋白质分离出来。双向电泳包括等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）两部分。前者根据蛋白质的等电点不同而将其分离，后者则是将不同分子量的蛋白质分开，经过2次电泳后得到的蛋白质图谱上的点可以视为单一的蛋白质。电泳后需要对凝胶进行染色脱色，使蛋白点显示出来，染色主要包括考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色等[1]。

应用质谱分析可以对蛋白质的序列进行测定，其原理是将样品分子离子化后，通过比较其质荷比的差异性，将蛋白质分离出来并确定其相对分子量。目前通过基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱技术，能够得到不同酶解肽段的分子量大小，从而获得该蛋白质的肽质量指纹图谱（Peptide Mass Fingerprinting，PMF），然后再搜索相应的数据库来鉴定该蛋白质[1]。

双向电泳质谱技术的优点是具有很强的蛋白质分离和相对定量能力，并能对蛋白质的翻译后修饰进行鉴定。缺点则是在电泳过程中一些极端碱/酸性蛋白质丢失情况比较严重，碱性蛋白分离效果不佳，不易得到极端分子量蛋白、膜蛋白和低丰度的蛋白、某些疏水蛋白难以检测，同时难以实现绝对定量和大规模的自动化分析[15]。

3.2多维色谱-质谱联用(MudPIT)技术

MudPIT技术先用特异性的胰蛋白酶消化蛋白样品，通过强阳离子交换柱和反相高效液相色谱分离消化产生的多肽，再进行ESI-MS/MS分析。试验组和对照组样品的蛋白质可以通过同位素亲和标签来标记，从而获得蛋白组的相关定量信息。测定样品制备过程中的肽回收率需要在蛋白质消化混合物中加入经13C标记的多肽。由于MudPIT法采用高灵敏度且高速的色谱分离法，避免了耗时的蛋白质2-DE分离法，因此与经典的双向电泳质谱法相比，MudPIT法快速灵敏、多肽分离通用性强、样品需要量较少等，但也存在着不能提供蛋白质翻译后修饰和异构体的相关信息的不足[16]。

3.3 SELDI-TOF-MS技术

SELDI技术通过液相或离子交换柱分离蛋白质，利用芯片上底物、抗体的亲和力的不同从蛋白质混合物中直接获取单个或多个目标蛋白，然后将蛋白离子化后再进行质谱鉴定。SELDI方法样品制备简便，样品的复杂性低，特别适于迅速检测表征低丰度蛋白质。然而该方法也存在着不足，目前仅能用于分离鉴定分子量不大于20 kD的蛋白质，而且同经典的2-DE-MS法相比分子量精确度较低[17]。

4蛋白组学在啤酒酵母研究中的应用

据报道，有些细胞是在蛋白质水平调控的生理变化的，而mRNA水平与蛋白表达水平并不总是一致[1，18]，因此，单凭转录组学分析往往不能得到全部重要的信息，而这些信息恰恰能通过蛋白组学十分明显快速地表现出来，因而在啤酒酵母研究中，转录组学和蛋白组学相结合已成为组学研究的趋势。相对于酿酒酵母，啤酒酵母蛋白组学的研究起步较晚，目前主要集中在啤酒酵母亲本的起源研究与鉴定，不同生长发酵阶段的蛋白组学分析，不同环境条件下的蛋白表达分析等。

4.1啤酒酵母亲本的起源研究与鉴定

啤酒酵母并非在自然界中分离得到，而是通过不同酵母杂交得到，不同的亲本赋予了啤酒酵母不同的特性，因此研究人员对啤酒酵母的起源和鉴定进行了研究。

Caesar等[11]通过对3株工业啤酒酵母CMBS33、OG2252和A15的蛋白组学分析，发现这3株啤酒酵母蛋白彼此相似，却与酿酒酵母BY4742差别很大。通过数据库分析发现3株工业啤酒酵母与非酿酒酵母S.bayanus蛋白组成最为接近。

Joubert等[20]对来自啤酒厂的不同啤酒酵母进行蛋白组学分析，发现拉格酵母不同于S.carlsbergensis、S.monacensis、S.pastorianus。拉格酵母一个亲本为近似酿酒酵母，另一亲本可视为啤酒酵母，最接近的是啤酒酵母NRRL Y-1551。同时该团队建立了拉格酵母的蛋白图谱，用于不同酵母的蛋白分析。

Kobi[9]团队建立了第一个爱尔啤酒酵母蛋白图谱，205个蛋白质点中有133个差异点得到鉴定。与拉格啤酒酵母、酿酒酵母S288c相比，爱尔啤酒酵母在蛋白组学上更接近于酿酒酵母，但两者同时存在Adh4p等基因表达的差异。

Joubert等[21]利用MALDI-TOF、MS/MS和数据库分析了30种拉格酵母，比较它们的蛋白组学与酿酒酵母的差异，发现在双向电泳图谱上，工业啤酒酵母已鉴定的蛋白质点与已知的酿酒酵母的蛋白质点并不完全一致，进而提出了采用MS技术鉴定工业啤酒酵母同源性蛋白的方法。

4.2不同生长发酵阶段的蛋白组学分析

随着啤酒酵母在啤酒发酵过程中的生长代谢，其细胞的蛋白组成也在不断发生变化。

在拉格啤酒酵母延滞期和对数前期蛋白和基因表达的研究中，J. Brejning等[22]利用转录组学和蛋白组学工具检测早期发酵水平，同Higgins等[22]的观点一样，转录组学和蛋白质组学是良好的检测工具。发酵早期诱导的蛋白Ade17p、Eno2p、Ilv5gp、Sam1p、Rps21p和Ssa2p已被成功鉴定。ADO1、ALD6、ASC1、ERG4、GPP1、RPL25、SSB1基因以及YKL056C蛋白不但在酿酒酵母基本培养基的对数前期表达，也同样在拉格啤酒酵母酿造过程的对数前期表达。

Berner等[23]通过比较爱尔啤酒酵母降解可发酵性糖能力的不同，进而研究从麦汁发酵到生成嫩啤酒（即发酵后尚未成熟的啤酒）过程的蛋白变化。研究人员对嫩啤酒和麦汁进行双向电泳蛋白组学分析，并通过SELDITOF-MS和MS/MS技术将嫩啤酒和麦汁中的特定蛋白分离出来，例如转脂蛋白（LTP1和LTP2）、蛋白酶Z和淀粉酶蛋白酶抑制剂。发酵过程中，两个相对应于LTP2的蛋白质点缺失，同时有3个蛋白质点仅在啤酒中发现。这3个新增加的蛋白全部来自于酵母，而且均与细胞壁蛋白有关，分别是Exg1（一种β-1，3-葡聚糖外切酶），Bgl2（一种β-1，2-葡聚糖内切酶）和Uth1（一种细胞壁生物起源蛋白质）。

许维娜等[24-25]发现在啤酒酵母青2自溶过程中，大量蛋白都被降解，蛋白数目快速减少（由629个蛋白质点减少到296个）早在蛋白提取时这一现象就被发现，要获得与正常细胞相同数量的蛋白质，需要大约1.5倍体积的自溶细胞。虽然蛋白的种类在自溶前后差异很大，但两者的蛋白有很高的匹配度（原有的296个蛋白点自溶后能够匹配270个）。一些蛋白质如Pep4、Adh1、Suc2、Eno2、Tpi1等，同时出现在多个蛋白点中，而这些点的等电点和（或）分子量有差异。其原因可能是在酵母自溶过程中蛋白质发生了翻译后修饰，例如磷酸化、糖基化、乙酰化等。例如，自溶后的蛋白图谱中初始有26个点被认为是新出现的，后经过质谱鉴定，其中18个点在自溶开始时就已存在，只是等电点和分子量在自溶过程中发生了变化。

4.3不同环境条件对啤酒酵母蛋白分泌的影响

在不同的环境条件下，如某些胁迫条件也会使啤酒酵母蛋白发生改变，从而适应外界环境对细胞造成的损害，这些蛋白的改变也正是酵母细胞的自我保护方式。

Kobi等[9]研究了生产规模上的爱尔啤酒酵母蛋白动力学，分别测定了第一代、三代酵母发酵初期和末期的蛋白变化。第一代中的蛋白变化与好氧生长到厌氧发酵的过渡有关，在第三代中，虽然这些蛋白很少变化，但与应激反应相关的蛋白如Hsp26p、Ssa4p和Pnc1p却在后面的传代中基本上表达出来。

Caesar等[11]发现在各种胁迫条件下，如对不同温度和高盐条件的适应上，酿酒酵母蛋白与近似S.bayanus的非酿酒酵母蛋白的调控存在差异，例如Arg1p、Sti1p和dc1p。实验比较了15℃和30℃培养条件下酵母的指数生长情况，啤酒酵母比酿酒酵母更适于在低温下生长。低温生长过程中，2种酵母的蛋白差异很小，2个温度条件下蛋白表达变化最大的是胁迫应答协同伴侣分子Sti1p，15℃下其表达量远大于30℃的表达量。Ipp1p和Arg1p 2种蛋白的表达调控均与环境有关，在15℃时Arg1p表达量高于30℃，酿酒酵母变种表达量增加5倍，而近似S.bayanus的非酿酒酵母只增加了2倍。

还有人研究了啤酒酵母对啤酒的影响。如张波[26]等通过双向电泳分析啤酒蛋白质组，发现除了麦芽溶解度和大麦品种会对啤酒中几种蛋白质的浓度造成影响外，一些来自酵母的蛋白质也可能影响啤酒的品质。酵母中的四类蛋白质——y-TRx2p、TPl、烯醇化酶和酵母磷酸转移蛋白Ypd1均在啤酒中被发现。这表明酵母细胞在发酵过程中就已遭到破坏，导致酵母中的这些蛋白质释放到啤酒中。但是TPl、y-TRx2p，烯醇化酶蛋白质点之间并没有明显的相关性。

5　展望

蛋白质组学能够在蛋白质水平上直接、大规模研究基因功能，是继生化手段研究蛋白质功能后的重大进展。但蛋白质组学技术仍有许多不足之处，例如对分离鉴定难溶性和极端等电点的蛋白质仍很困难，某些重要蛋白质的信息可能会在检测过程中丢失。因此不但要综合应用现有的技术取长补短，还要继续发展蛋白质组学相关研究技术，增加其敏感性、稳定性、特异性和可重复性[2]。

啤酒由于独特风味和营养价值而备受人们青睐，其重要部分——啤酒酵母的研究也逐渐深入，从开始的发酵性能的研究，到如今的组学的探索，无不完善着人们对于啤酒酵母的认识与了解，从而更好的为啤酒生产服务。随着蛋白质组学技术的不断发展，相关数据库的不断充实，蛋白质组学会有更广阔的发展前景，对啤酒酵母的研究也会做出更具突破性的贡献。

参考文献：

[1]龙娟,杨晓红,于桂宝.微生物蛋白组学的发展及前景[J].生物技术通报, 2006(增刊)：91-99.

[2]李学鹏,励建荣,于平,等.蛋白组学及其在食品科学研究中的应用[J].中国粮油学报, 2010, 25(2)：77-83.

[3] Powell C D, Quain D E, Smart KA. The impact of brewing yeast cell age on fermentation performance, attenuation and flocculation[J]. FEMS Yeast Res, 2003(2)：147-159.

[4] Liu Z, Zhang G, Liu S. Constructing an amylolytic brewing yeast Saccharomyces pastorianus suitable for accelerated brewing[J]. J Biosc Bioeng, 2004, 98(6)：414-419.

[5] Dunn B, Sherlock G.Reconstruction of the genome origins and evolution of the hybrid lager yeast Saccharomyces pastorianus [J]. Genome Res, 2008(18)：1610-1623.

[6] Nakao Y, Kanamori T, Itoh T, et al. Genome sequence of the lager brewing yeast, an interspecies hybrid[J]. DNARes, 2009 (16)：115-129.

[7] Horinouchi T, Yoshikawa K, Kawaide R, et al. Genome-wide expression analysis of Saccharomyces pastorianus orthologous genes using oligonucleotide microarrays[J]. J Biosci Bioeng, 2010, 110(5)：602-607.

[8] Saerens S M G, Duong C T, Nevoigt E. Genetic improvement of brewer's yeast: current state, perspectives and limits[J]. Appl Microbiol Biot, 2010, 86(5)：1195-1212.

[9] Dominique K, Sandra Z, Serge P, et al. Two-dimensional protein map of an“ale”-brewing yeast strain: proteome dynamics during fermentation[J]. FEMS Yeast Research, 2004, 5(3)：213-300.

[10] Gonzalez S, Barrio E, Querol A. Molecular characterization of new natural hybrids of Saccharomyces cerevisiae and S. kudriavzevii in brewing[J].Appl Environ Microb, 2008, 74：2314-2320.

[11] Robert C, Johan P, John S G, et al. Comparative proteomics of industrial lager yeast reveals differential expression of The cerevisiae and non-cerevisiae parts of their genomes[J]. Proteomics, 2007, 7(22)：4135-4147.

[12] Sato M, Kishimoto M, Watari J, et al. Breeding of brewer’s yeast by hybridization between a top-fermenting yeast Saccharomyces cerevisiae and a cryophilic yeast Saccharomyces bayanus[J].J Biosci Bioeng,2002(5)：509-511.

[13] GoffeauA, Barrell B G, Bussey H, et al. Life with 6000 genes [J]. Science, 1996, 274(5287): 546-547.

[14] Wasinger V C, Cordwell S J, Cerpa-Poljak A, et al. Progress with gene-product mapping of the mollicutes: Mycoplasma genitalium[J]. Electrophoresis, 1995, 16：1090-1094.

[15]何庆华,吴永宁,印遇龙.蛋白组学技术及其在营养学研究中的应用[J].食品科学, 2008, 29(4)：439-442.

[16] Michael PW. Utilization of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (Mud PIT) [J]. Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 2004, 3：280-286.

[17] Issaq H J, Veenstra T D, Conrads T P, et al. The SELDITOFMS approach to proteomics: Protein profiling and biomarker identification[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002, 292(3)：587-592.

[18] Lackner D H, Schmidt M W, Wu S, et al. Regulation of transcriptome, translation, and proteome in response to environmental stress in fission yeast[J]. Genome Biol, 2012, 13(4)：R25.

[19] Karhumaa K, Pahlman AK, Hahn-Hagerdal B, et al. Proteome analysis of the xylose-fermenting mutant yeast strain TMB 3400[J]. Yeast, 2009, (26)：371-382.

[20] Joubert R, Brignon P, Lehmann C, et al. Two-dimensional gel analysis of the proteome of lager brewing yeasts[J]. Yeast, 2000, 16(6)：511-522.

[21] Joubert R, Strub J M, Zugmeyer S, et al. Identification by mass spectrometry of two-dimensional gel electrophoresisseparated proteins extracted from lager brewing yeast[J]. Electrophoresis, 2001, 22(14)：2969-2982.

[22] Brejning J,Arneborg N, Jespersen L. Identification of genes and proteins induced during the lag and early exponential phase of lager brewing yeasts[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 98(2)：261-271.

[23] Berner T S, Jacobsen S,Arneborg N. The impact of different ale brewer’s yeast strains on the proteome of immature beer [J]. BMC Microbiology, 2013, 13(1)：215.

[24]许维娜.啤酒酵母自溶评价及机理研究[D].无锡：江南大学, 2014.

[25] Xu W N, Wang J J, Li Q. Comparative proteome and transcriptome analysis of lager brewer's yeast in the autolysis process[J]. FEMS Yeast Research, 2014, 14(8)：1273-1285.

[26]张波,管政兵,陆健,等.新的啤酒蛋白质组图谱的构建及在啤酒质量控制方面的应用[J].啤酒科技, 2011(2)：58-67.

Research Progress in Proteomics of Beer Yeast

GUO Xuan, LUAN Bo, ZHAO Xue, WANG Wei, LI Xianzhen and YU Zhimin
(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian, Liaoning 116034, China)

Abstract:Beer yeast plays an important role in beer production. However, beer yeast has never been isolated from the nature, it is obtained by a hybrid of S.cerevisiae and other strains. Therefore, beer yeast has unique properties different from S.cerevisiae. With the advent of genome era, the research on beer yeast has gradually come into omics research from yeast fermenting performance research, and proteomics is an important part of omics research. Proteomics is to study all the features and functions of cellular proteins under a given state. At present, proteomics is mainly applied in the research on the origin and identification of beer yeast parent, protein changes in different stages of growth and fermentation, and protein expression under environmental stress conditions and so on. Further research on the protemics of beer yeast is of great significance in beer yeast research and beer quality control.

Key words:beer yeast；proteomics analysis；research progress

作者简介：郭璇(1990-)，女，在读硕士。

收稿日期：2015-08-05

基金项目：大连市科学技术基金，编号：2013J21DW007；国家自然科学基金，编号：31401681。

DOI：10.13746/j.njkj.2015333

中图分类号：TS261.1；TS261.4；TS62.5

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）01-0103-04