添加普鲁兰酶对啤酒酵母生长的影响

汪裕强

（黔南州食品药品检验所，贵州都匀 558000）

普鲁兰酶能够专一性切开α-1，6糖苷键并形成直链淀粉[1-2]，该酶符合联合国粮农组织和世界卫生组织要求的食品级酶制[3]，但普鲁兰酶在食品加工方面的应用甚少。经研究发现，普鲁兰酶能够增加啤酒中的风味物质和提高发酵度[4-5]，而啤酒酵母与啤酒发酵密切相关[6-9]。

本文通过添加0、60、90、120 U/kg普鲁兰酶，观察啤酒酵母菌落形态和生长曲线，研究普鲁兰酶对啤酒酵母的影响，希望为普鲁兰酶作用的开发和提高啤酒酵母的利用率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

普鲁兰酶（酶活力为1 000 U/mL，最适pH 4.5～5.5，最适温度55～60℃）、安琪啤酒干酵母、酵母膏、琼脂、二棱大麦。

1.2 仪器与设备

超净工作台、721分光光度计、水浴恒温振荡器、微生物培养箱、可调式移液器、接种环、高压灭菌锅。

1.3 方法

1.3.1 制备麦芽汁固体培养基

大麦经制麦、发芽等过程获得麦芽，粉碎麦芽，加水于60℃糖化2～3 h，搅拌至糖化完全，糖化液经12层纱布过滤后获得麦芽汁。取1 000mL锥形瓶，加入麦芽汁800mL、琼脂16 g、酵母膏72 g，用棉花封瓶，置于灭菌锅灭菌1.05 kg/cm2，20 min；在培养基灭菌后倒平板25mL且未凝固前添加不同浓度的普鲁兰酶，混匀备用。制作麦芽汁斜面培养基：取15mm×150mm试管，加入4mL麦芽汁，用棉花封好试管口，用报纸包裹好置于灭菌锅灭菌1.05 kg/cm2，20 min。

1.3.2 观察啤酒酵母菌落

将啤酒酵母活化后，从瓶子中接种到10mL麦芽汁斜面培养基中复壮最少4支，于25℃培养25 h。按照无菌操作从4支斜面培养基中选出生长良好的进行斜面划线3个，于25℃培养48 h。按照无菌操作挑选健壮、饱满的4～5个啤酒酵母分别接种到添加不同浓度普鲁兰酶的麦芽培养基上于25℃培养。分别于4 d后和11 d后，在麦芽汁培养基上观察啤酒酵母菌落。

1.3.3 测定啤酒酵母的生长曲线

麦芽汁液体培养基配制：取1 000mL锥形瓶，加入麦芽汁800mL、酵母膏72 g，用棉花封瓶，置于灭菌锅灭菌1.05 kg/cm2，20 min。用接种环从斜面培养基上挑取1环菌；接种于10mL麦芽汁液体培养基，于25℃恒温培养48 h，作为种子液。取种子液10mL接种于100mL麦芽汁液体培养基，在28℃恒温200 r/min振荡培养20 h，此时培养液浑浊。将721型分光光度计波长调整至560 nm，预热30 min。取盛有90mL无菌麦芽汁液体培养基的250mL锥形瓶5个，各加入振荡培养20 h的酵母培养液10mL，于25℃下恒温振荡培养，培养6 h后每瓶分别加入0、6、9、12 μL普鲁兰酶。于0、4、8、12、16、20、24、28、32 h和36 h分别用无菌移液管从各瓶吸取培养液2mL，经过一系列梯度稀释后，以未接种的麦芽汁液体培养基校正比色计的零点，在光密度为560 nm条件下测定吸光值（A）记录于表格中，每个吸光值测3次（n=3），以时间（h）为横坐标，吸光值（A560）×稀释倍数为纵坐标绘制成酵母生长曲线[8-10]。

1.3.4 数据分析

利用DPS数据处理系统对实验数据进行F检验。

2 结果与分析

2.1 普鲁兰酶对啤酒酵母菌落的影响

将啤酒酵母通过无菌操作培养在添加4种不同浓度（0、60、90、120 U/kg）普鲁兰酶的麦芽培养基上，于4 d后观察啤酒酵母菌落的形态，如图1A～1D所示；于11 d后观察啤酒酵母菌落的形态，如图2A～2D。

图1 添加普鲁兰酶4 d后啤酒酵母的菌落形态

在添加普鲁兰酶4 d后，啤酒酵母都在麦芽培养基上出现明显的白色菌落（图1），此时经4种不同普鲁兰酶浓度处理的啤酒酵母菌落颜色都很暗，菌落呈现的差异不明显。

图2 添加普鲁兰酶11 d后啤酒酵母的菌落形态

添加普鲁兰酶11 d后），啤酒酵母在麦芽汁培养基上都形成差异明显的乳白色菌落。在普鲁兰酶的添加量为0 U/kg的条件下（图2A），啤酒酵母的菌落小且不饱满，表明啤酒酵母在未添加普鲁兰酶的条件下，生长缓慢不够发达。在普鲁兰酶的添加量为60 U/kg的条件下（图2B），啤酒酵母的生长得到促进，菌落比未添加普鲁兰酶的大、饱满且有光泽。啤酒酵母在普鲁兰酶的添加量为90 U/kg的条件下（图2C），较添加60 U/kg普鲁兰酶而言，体积、饱满程度相差不大。当普鲁兰酶的添加量为120 U/kg时（图2D），啤酒酵母的生长状况有明显的促进作用，菌落颜色呈乳白色、有光泽、最饱满，且生长旺盛的孢子散落在其他未点样的地方。结合啤酒酵母在麦芽培养基的生长状况（图1和图2)，随着普鲁兰酶添加量的增多和时间的推移，啤酒酵母在麦芽汁培养基的生长状况出现了明显的变化，对啤酒酵母生长的促进作用随着普鲁兰酶浓度的升高而增加。这系由于在啤酒酵母代谢过程中，普鲁兰酶将麦芽汁中的使α-1，6糖苷键脱支，促进糖化分解，且普鲁兰酶本身无毒无害，不会对啤酒酵母产生质的变化，则啤酒酵母能充分利用培养基中的单糖以补充自身生长所需的碳源，充足的酵母膏为啤酒酵母提供生长所需的氮源，因而啤酒酵母在添加普鲁兰酶的培养基上形成的菌落更大更饱满。综上所述，普鲁兰酶对啤酒酵母的生长有良好的促进作用。

2.2 普鲁兰酶对啤酒酵母生长的影响

将啤酒酵母培养在添加4种不同普鲁兰酶浓度的麦芽汁液体培养基中，于0、4、8、12、16、20、24、28、32 h和36 h分别用无菌移液管从各瓶吸取培养液2mL，经过一系列梯度稀释后，以未接种的麦芽汁液体培养基校正比色计的零点，利用DPS数据处理系统，在光密度为560 nm的条件下测定吸光值，见表1，每个吸光值测3次（n=3），并进行方差分析（表2）。最后以时间（h）为横坐标，吸光值（A560）×稀释倍数为纵坐标制作出四条酵母生长曲线，如图3所示。

根据方差分析表（表2）可知，时间处理的F值为28.592 6，普鲁兰酶浓度处理的F值为2 171.846 6，则普鲁兰酶的影响效果更为显著，且P值均小于0.001，因此本研究的结果有极显著差异。本研究的误差项很小，说明本研究的精确度高。

图3 不同普鲁兰酶浓度下啤酒酵母的生长曲线

表1 添加四种浓度普鲁兰酶后啤酒酵母在不同时间培养液的吸光度（±S）

表1 添加四种浓度普鲁兰酶后啤酒酵母在不同时间培养液的吸光度（±S）

注：1.吸光度为3次重复的平均值±标准差；2.同列数字旁星号表示有显著差异（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01)。

时间/h 0 U/kg 60 U/kg 90 U/kg 120 U/kg 稀释倍数0 0.038±0.002** 0.038±0.002** 0.039±0.003** 0.039±0.003** 14 0.069±0.005** 0.072±0.006** 0.073±0.005** 0.076±0.007** 18 0.177±0.011** 0.193±0.013** 0.199±0.014** 0.230±0.016** 1 12 1.189±0.037** 1.242±0.044** 1.254±0.050** 1.277±0.054** 5 16 3.101±0.111** 3.332±0.126** 3.512±0.123** 3.700±0.134** 10 20 4.105±0.160** 4.425±0.183** 4.618±0.177** 4.825±0.189** 15 24 7.420±0.211** 7.742±0.236** 7.910±0.242** 8.218±0.257* 20 28 8.510±0.295* 8.850±0.308* 9.112±0.312* 9.324±0.318* 30 32 8.815±0.283** 9.170±0.309* 9.398±0.312* 9.582±0.334* 30 36 3.876±0.165** 4.127±0.161** 4.295±0.169** 4.581±0.177** 20 40 2.586±0.138** 2.858±0.163** 2.994±0.151** 3.210±0.174** 15 44 2.546±0.160** 2.799±0.167** 2.920±0.142** 3.101±0.168** 10 48 2.579±0.173** 2.829±0.177** 2.952±0.182** 3.123±0.198** 10

表2 方差分析表

本研究采用比浊计数法，经一系列梯度稀释后，根据测定的吸光值（表1）绘制成4条生长曲线（图3），啤酒酵母在不同普鲁兰酶浓度处理下均出现了4个阶段：啤酒酵母的生长在0～8 h为迟缓期，8～24 h为指数期，24～36 h为稳定期，36 h后进入衰亡期，这也是4条生长曲线的共性，在30 h时生长最为旺盛，菌株活力很强，吸光值×稀释倍数达到9以上，十分适合菌种采样，生长曲线反映了啤酒酵母在培养繁殖过程中的生长规律，则普鲁兰酶不会对酵母细胞的生长周期产生影响。但从纵向观察四条生长曲线，当加入不同浓度的普鲁兰酶后，吸光值A（代表样品菌液浓度）随着普鲁兰酶浓度的升高而增加，根据朗伯比尔定律（A=Kbc），在摩尔吸光吸收系数K与吸收层厚度b不变的条件下，吸光度A只与物质的浓度c有关，因此经4种浓度处理后的啤酒酵母在液体培养基中的吸光值（A560）与细菌悬浊液成正比关系，通过分光光度计测量后就掌握了酵母细胞的浓度变化。当添加普鲁兰酶浓度为60 U/kg时，R2（决定系数）=0.183 3。当添加普鲁兰酶浓度为60 U/kg时，酵母细胞浓度从指数期开始比添加0 U/kg普鲁兰酶时高，增幅较大，R2=0.196 9。当添加普鲁兰酶浓度为90 U/kg时，酵母细胞浓度从指数期开始比添加60 U/kg普鲁兰酶时高，增幅较小，两条曲线之间的间隙也较小，R2=0.201 6。当添加普鲁兰酶浓度为120 U/kg时，酵母细胞浓度从指数期开始比添加90 U/kg普鲁兰酶时高，而增幅非常小，R2=0.212 1。由于四条酵母生长曲线R2都趋近于0，因此吸光度A与时间的线性关系很小。

由于在啤酒酵母代谢过程中，普鲁兰酶将麦芽汁中的使α-1，6糖苷键脱支，促进糖化分解，且普鲁兰酶本身无毒无害，啤酒酵母能充分利用培养基中的单糖以补充自身生长所需的碳源，充足的酵母膏为啤酒酵母提供生长所需的氮源。啤酒酵母在添加普鲁兰酶的液体培养基中细胞分化就很旺盛，酵母细胞浓度也就高，表明普鲁兰酶对啤酒酵母的生长有良好地促进作用，确保后续能够在发酵时添加普鲁兰酶的条件下进行良好地生长代谢。

3 结论

本研究在麦芽汁培养基中添加（0～120 U/kg）普鲁兰酶，普鲁兰酶使麦芽汁中的使α-1，6糖苷键脱支，促进糖化分解，经过观察啤酒酵母菌落形态和生长曲线，当添加普鲁兰酶浓度为120 U/kg时，酵母细胞浓度最高。这是由于普鲁兰酶本身无毒无害，啤酒酵母能充分利用培养基中的单糖以补充自身生长所需的碳源，充足的酵母膏为啤酒酵母提供生长所需的氮源，有利于其对糖类物质的利用，促进啤酒酵母产生更多的酒精和CO2。该结果不仅具有重要的理论意义，扩宽普鲁兰酶的应用领域，还能提高啤酒酵母的利用率，对强化食品发酵及风味改善有积极作用。

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