重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的构建及其杀瘤活性

2020-04-18 08:29李丹洋方敬敬
基础医学与临床 2020年4期
关键词:痘病毒质粒引物

李丹洋,方敬敬,唐 慧*

(1.云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院 临床基础医学研究所 云南省临床病毒学重点实验室昆明市肿瘤分子与免疫防治重点实验室,云南 昆明 650032;2.昆明理工大学 医学院,云南 昆明 650504)

溶瘤病毒(oncolytic virus, OV)是指将某些病毒通过基因工程改造后,成为能有效感染肿瘤细胞并在其中大量复制、导致肿瘤细胞溶解的基因工程病毒[1-2]。CCL5 和SSTR2 具强力抗肿瘤作用。CCL5可趋化多种白细胞如T、单核、NK和嗜酸/碱性粒细胞向肿瘤组织浸润,强化宿主抗肿瘤的免疫反应,其在肿瘤的发生、发展和转归中均发挥重要的作用[3]。SSTR的2型受体(somatostatin receptor 2, SSTR2)被认为与肿瘤的关系密切[4]。生长抑素或生长抑素类似物(somatostatin analogue, SSA)可通过SSTR2抑制肿瘤增生、诱导肿瘤细胞凋亡,并参与免疫系统调控。奥曲肽(octreotide, SMS201-995)是最常用的SSA,能与SSTR2特异性结合。

本研究构建的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+包含具有强力抗肿瘤效应的CCL5和SSTR2,经同源重组,该溶瘤痘病毒自身携带一个失活的胸苷激酶(thymidine kinase, TK)基因,用于增强病毒的肿瘤杀伤特异性。同时,稳定且持续的高浓度CCL5 能将肿瘤细胞从无免疫原性变为强免疫原性,可定向诱导T、NK 细胞靶向杀伤肿瘤细胞;而SSTR2 在肿瘤内大量表达,将精确定向并诱导SSA 奥曲肽到达SSTR2 阳性的肿瘤部位与其结合从而抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞凋亡;最终该重组溶瘤痘病毒将通过机体免疫及病毒本身溶瘤机制发挥“免疫/溶瘤”的双重协同抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及试剂盒:胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、TrypLETMExpress Enzyme消化液、非必需氨基酸(non-essential amino acids, NEAA)和丙酮酸钠(pymvate sodium, NaP)(Gibco公司);MEM培养基、DMEM培养基、PBS和青霉素-链霉素溶液(Hyclone公司);人外周血淋巴细胞分离液(北京Solarbio公司);CMC和BrdU(Sigma-Aldrich公司);大肠杆菌Stbl3菌株(北京博迈德生物公司);CCK-8试剂盒(江苏碧云天生物科技有限公司);核酸酶Benzonase®nuclease(Novagen公司);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);RIPA蛋白裂解液及beta-actin mouse McAb(Protenintech公司);CCL5 ELISA试剂盒和抗SSTR2蛋白抗体(Abcam公司)。

1.1.2 细胞、质粒和病毒株:非洲绿猴肾细胞系BSC-1(中国典型培养物保藏中心细胞库,CCTCC);人骨肉瘤细胞系143B(美国模式培养物集存库,ATCC);人宫颈癌细胞系HeLa和人大肠癌细胞系HCT116(中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库);pSC65质粒和痘病毒vaccinia virus(ATCC®VR-1354TM)(WR, NIH TC-adapted)株(BioVector中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心-NTCC国家典型培养物保藏中心);含T2A-Luc的克隆载体质粒pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Luc和含CCL5及SSTR2的克隆载体质粒pDONR223(由上海汉恒生物科技有限公司协助构建)。

1.2 方法

1.2.1 痘病毒真核表达载体pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+的构建: pSC65作为构建人CCL5和SSTR2的痘病毒真核表达载体质粒,该质粒全长7 262 bp。其结构及多克隆位点(multiple cloning site, MCS)(图1,2,表1)。

本研究以含目的基因序列的质粒DNA为模板,利用引物(表2)和高保真酶进行多轮PCR反应扩增相应目的序列,经酶切、连接及筛选后获得目的质粒,具体构建步骤为(图3):

图1 pSC65载体质粒图谱Fig 1 pSC65 vector plasmid map

图2 pE/L 和p7.5 启动子和MCS 序列Fig 2 pE/L and p7.5 promoter and MCS sequence

表1 质粒pSC65各组成元件的起止位置

1)以pDONR223质粒(含CCL5目的基因序列)为模板,用引物①和②扩增CCL5及部分T2A序列。PCR反应体系50 μL:10×PCR 缓冲液 5 μL,MgSO42 μL,dNTPs 5 μL,上游/下游引物 1 μL,KOD plus 1 μL,质粒模板 0.5 μL,ddH2O 34 μL;PCR反应条件:预变性95 ℃ 5 min;94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 90 s,25个循环;最后72 ℃延伸5 min。

2)以步骤1)的PCR产物为模板,用引物①和③进行PCR反应,延长步骤1)反应产物中的T2A序列,该反应产物中T2A部分为构建质粒中T2A的全序列。该PCR反应体系中模板为步骤1)PCR产物,PCR条件同步骤1。

3)以pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Luc质粒(含T2A-Luc目的基因序列)为模板,用引物④和⑤扩增Luc基因及部分T2A序列。PCR反应体系及条件同步骤1。

4)以2)和3)的反应产物为模板,用引物①和⑤进行PCR反应得到CCL5-T2A-Luc全序列。PCR反应体系50 μL:10×PCR 缓冲液 5 μL,MgSO42 μL,dNTPs 5 μL,上游/下游引物1 μL,KOD plus 1 μL,2)和3)的反应产物各0.35 μL,ddH2O 33.8 μL;PCR反应条件同步骤1)。

5)Xho/Eco双酶切pSC65载体,切除掉lacz (约3 ku),然后分别将CCL5-T2A-Luc和Luc连接克隆入载体中,构建pSC65-CCL5-T2A-Luc和pSC65-Luc重组载体,连接后产物经Stbl3大肠杆菌转化,经含100 μg/mL氨苄抗生素的LB平板筛选;应用PCR鉴定阳性菌落;对阳性菌落PCR产物进行测序鉴定。

6)以pDONR223质粒(含SSTR2目的基因序列)为模板,用引物⑥和⑦扩增SSTR2目的基因序列,PCR反应体系及条件同步骤1)。

7)kpnⅠ单酶切pSC65-CCL5-T2A-Luc重组载体,插入SSTR2序列,连接后产物经步骤5)中筛选鉴定后即完成pSC65-CCL5-Luc-SSTR2和pSC65-Luc+重组载体的构建,分别命名为pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+和pSC65-Luc+。

1.2.2 同源重组构建pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+/pSC65-Luc+重组痘病毒:以6孔板接种BSC-1细胞,培养至80%汇合度后以病毒滴度为MOI=0.05 PFU/细胞感染BSC-1细胞1~2 h,用Lipofectamine 2000将质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+和pSC65-Luc+分别转染细胞,操作过程按照Lipofectamine 2000脂质体转染说明书进行。37 ℃,5% CO2培养箱中培养4~6 h后换为完全培养基,继续培养48~72 h。于显微镜下观察细胞状态,直至大部分细胞出现被感染的病理现象,收集细胞离心重悬于1 mL MEM中,分别依次置于-80 ℃和37 ℃反复冻融3次。超声处理以上冻融液1 min后,300×g离心5 min,收集上清病毒液(含重组痘病毒和野生型痘病毒),保存于-80 ℃冰箱中备用。

表2 各PCR反应引物及目的片段Table 2 PCR primers and target fragments

1.2.3 痘病毒阳性重组子的筛选纯化:将1.2.2中收集的病毒液用含终浓度为0.05 mg/mL BrdU的MEM-5进行稀释,稀释度为1/200、1/800、1/3 200、1/12 800……共12个稀释度。待143B细胞增殖至80%汇合度时,将以上12个稀释度的混合病毒液依次加入每孔,100 μL /孔,每个稀释度对应3×8个孔,37 ℃,5% CO2培养箱中培养24 h后,在96孔板中加入1‰荧光素酶底物,置于小动物活体成像系统(IVIS Lumina Series Ⅲ Imaging System)下检测,用记号笔标记有荧光活性的孔。收集荧光素酶活性高且稀释度高的孔内病毒混合液,并刮下该孔的细胞,重悬于100 μL MEM中,分别依次置于-80 ℃和37 ℃反复冻融3次,超声波处理1 min。4 ℃,300×g,离心5 min,收集上清病毒液于-80 ℃保存。以上为一轮完整的痘病毒阳性重组子筛选纯化过程,重复上述痘病毒阳性重组子筛选纯化过程共23次,获得纯化的痘病毒阳性重组子。

1.2.4 重组痘病毒的扩大培养及浓缩纯化:接种HeLa细胞于25 cm2的培养瓶中,待细胞增殖至约80%汇合度时,弃培养上清,将含病毒悬液的4 mL RPMI-1640 培养基加入培养瓶中继续培养48~72 h,直至绝大部分细胞表现出被感染的病理现象,收集细胞离心重悬于1 mL RPMI-1640中,分别在-80 ℃和37 ℃中反复冻融3次,超声波处理1 min,离心机转头预冷至4 ℃,300×g离心5 min,收集上清病毒液,重复以上感染和病毒收集的步骤,直至获得足量病毒液。转移病毒冻融液至50 mL离心管,300×g离心5 min(离心机提前预冷至4 ℃),取上清。将每7.5 mL含病毒的上清沿管壁缓慢加在18 mL 36%蔗糖溶液之上,12 500 r/min,离心80 min,小心移除上清,沉淀即为痘病毒,将沉淀重悬于10 mL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)中并加入1.5 μL Benzonase®核酸酶,室温放置2 h,之后用中空纤维膜过滤法浓缩纯化痘病毒至1.5 mL左右,收集浓缩纯化后病毒于1.5 mL冻存管,-80℃保存备用。

1.2.5 结晶紫染色法测定重组痘病毒滴度:接种BSC-1细胞于6孔板中,待细胞增殖至90% 汇合度时,开始病毒滴度测定。取5 μL待测痘病毒液用MEM培养基按比例进行10倍梯度稀释,最终稀释为10-2、10-3、10-4、10-5和10-65个稀释度和Mock对照组。弃去6孔板中培养液,加入100 μL经稀释的不同梯度的病毒液,每个稀释度作2个复孔,于37 ℃,5% CO2培养箱中培养1 h,期间每10 min摇晃6孔板1次,使病毒液平均覆盖于BSC-1细胞之上。1 h后,将事先配制好的培养基(MEM-10和3% CMC等量混合)沿孔壁缓慢加入6孔板中继续培养72 h。弃培养液,加入0.1% 结晶紫染色液,3 h后PBS洗去多余染色液并晾干。选取病毒空斑数量适中的孔,计数病毒空斑个数,根据病毒滴度计算公式:空斑平均数 × 稀释倍数/加入病毒液体积(mL),计算出病毒滴度(PFU/mL)。

1.2.6 ELISA和Western blot 分别验证重组痘病毒的CCL5和SSTR2蛋白表达: 按照实验设计,CCL5蛋白为分泌蛋白,将被释放至培养液中,而SSTR2在细胞中表达。因此,将纯化的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+及其对照rVV-Luc+感染HeLa细胞60 h后,分别收集细胞培养上清和细胞。ELISA检测细胞培养上清中CCL5的表达水平,Western blot检测细胞总蛋白中SSTR2的表达水平。

1.2.7 CCK-8测定重组痘病毒肿瘤细胞杀伤活力:处于对数期的人大肠癌细胞HCT116、人宫颈癌细胞HeLa和对照组人胚肾上皮细胞HEK293T,按5 000个细胞/孔接种于96孔培养板,隔夜待细胞贴壁后,加入重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+及其对照rVV-Luc+(MOI=10),于5% CO2,37 ℃培养箱中培养24、48和72 h后,应用CCK8检测其对各细胞系的杀伤活力。

2 结果

2.1 重组质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc的构建与鉴定

基因片段进行连接、转化、涂板后,分别挑选了8个pSC65-CCL5-Luc和7个pSC65-CCL5-SSTR2-Luc连接产物转化菌落进行PCR鉴定,分别得到4个和6个阳性菌落,菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳可见含CCL5-Luc基因的片段(约2 000 bp)和含SSTR2的片段(1 110 bp)的单一条带,与预期相符(图4,5)。且测序验证其CCL5-Luc(图6)和SSTR2基因(图7)的序列与标准序列(CCL5, NM_002985.2; SSTR2, NM_001050.2)一致,将该质粒命名为pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+,用于后续实验。

图3 重组质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+构建流程示意图Fig 3 Schematic diagram of recombinant plasmid pSC65- CCL5-SSTR2-Luc+ construction

1.DNA marke; 2-9.identification of pSC65-CCL5-Luc monoclonal PCR product图4 pSC65-CCL5-Luc单克隆PCR产物鉴定Fig 4 Identification of pSC65-CCL5-Luc monoclonal PCR product by gel electrophoresis

1.DNA marker; 2-8.identification of SSTR2 monoclonal PCR product图5 pSC65-CCL5-SSTR2-Luc单克隆PCR产物凝胶电泳鉴定Fig 5 Identification of pSC65-CCL5-SSTR2-Luc monoclonal PCR product by gel electrophoresis

2.2 重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+/ rVV-Luc+的筛选纯化和病毒滴度测定

重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+经23轮筛选纯化后获得的病毒滴度=(90+92+91)/3×103/0.1=9.1×105PFU/mL。

2.3 重组痘病毒阳性重组子rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的蛋白表达验证

重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的CCL5蛋白表达水平显著高于对照组rVV-Luc+(P<0.05)(图8);rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的SSTR2蛋白表达水平显著高于对照组rVV-Luc+(P<0.05)(图9)。

2.4 CCK-8检测rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对肿瘤细胞系的杀伤活力

rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对人胚肾上皮细胞HEK293T杀伤活力极低,而对2种肿瘤细胞系均显示出一定的杀伤活力,并且其杀伤活力随感染时间逐步增强;并且rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对肿瘤细胞的杀伤活力较对照组rVV-Luc+均显著升高(HCT116:感染48 h时P<0.05;HeLa:感染48 h时P<0.05,72 h时P<0.01)(图10)。

图6 CCL5-Luc测序结果比对(绿色阴影区域为与目的序列匹配部分)Fig 6 CCL5-Luc sequencing result alignment (shaded area matches the target sequence)

图7 SSTR2测序结果比对(绿色阴影区域为与目的序列匹配部分)Fig 7 SSTR2 sequencing result alignment (shaded area matches the target sequence)

*P<0.05 compared with rVV⁃Luc group图8 ELISA检测HeLa细胞培养上清中CCL5的表达水平Fig 8 Detection the expression level of CCL5 in cell culture supernatants of HeLa by ELISA

*P<0.05 compared with rVV⁃Luc group图9 Western blot检测HeLa细胞裂解液中SSTR2的表达水平Fig 9 Detection the expression of SSTR2 in cell lysis of HeLa by Western blot n=3)

*P<0.05,**P<0.01 compared with HeLa⁃rVV⁃Luc group;#P<0.05 compared with HCT116⁃rVV⁃Luc group图10 CCK8检测rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对3株细胞系的杀伤活力Fig 10 Killing activity of rVV-CCL5-SSTR2-Luc+ on three cell lines were detected by CCK8

图11 重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+ 的构建原理Fig 11 Construction principle of recombinant oncolytic vaccinia virus rVV-CCL5-SSTR2-Luc+

3 讨论

近年来,肿瘤免疫治疗取得飞速发展,引领了肿瘤治疗领域的重大突破。2015—2019年,肿瘤的免疫治疗连续5年入选美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology, ASCO)年度报告的“临床肿瘤年度进展”[5-9]。以溶瘤病毒为代表的肿瘤免疫治疗也越来越引人瞩目。

本研究构建的含外源基因的穿梭质粒,此穿梭质粒外源基因序列的两侧带有与野生病毒株同源的DNA序列,将此携带了外源基因的重组穿梭质粒转染入已经感染了野生型WR痘病毒病毒株的细胞,含外源基因的穿梭质粒两侧带有同源序列的DNA即与野生型病毒株的同源序列DNA之间发生同源重组(图11),从而获得TK基因敲除,同时插入了人CCL5和SSTR2基因和作为筛选标记的荧光素酶报告基因(luciferase, Luc)的重组痘病毒rVV,rVV通过感染敏感的宿主细胞HeLa使该外源基因得以表达。本研究在蛋白水平验证了感染重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的HeLa细胞的CCL5和SSTR2蛋白表达水平显著高于对照组rVV-Luc+(均为P<0.05)。并且CCK8体外细胞杀伤实验也初步验证了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+较对照组rVV-Luc+对HCT116和HeLa细胞具有更高的杀瘤活性。

目前,通过采用删除或插入相关基因获得多种不同的重组痘病毒,使其可以选择性地靶向杀伤肿瘤细胞,且获得了一些较好的临床前和早期临床试验结果[10-11]。特别是2015 年 10 月,美国FDA批准ImlygicTM(talimogene laherparepvec, T-VEC)用于治疗黑色素瘤,它是一种基于单纯疱疹病毒的溶瘤病毒疗法,也是FDA批准的首个溶瘤病毒疗法,这一事件标志着溶瘤病毒的研究已迈入了一个全新的发展阶段[12-13]。

本研究成功构建了重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+,并验证了其对部分肿瘤细胞的杀伤活力,为今后开展溶瘤痘病毒单独或与其他肿瘤免疫治疗药物联合治疗肿瘤奠定了实验基础。

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