脂肪酸代谢酶的表达异常对孤独症的诊断意义

陈建玲，傅迎美，禹顺英，陈 静，杜亚松*

(上海交通大学 医学院 附属精神卫生中心 1.儿少科；2.上海市重性精神病重点实验室，上海 200030 ；3.纽约州立基础研究院 神经生化研究室，美国 纽约 10314)

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)主要表现为社会沟通和社会交往缺陷，以及局限、重复的行为、兴趣或活动[1]。ASD的病因及发病机制未明。有研究报道突触修剪障碍可能参与ASD的发病[2]。而脂肪酸(fatty acid，FA)在突触发育和形成中发挥重要作用[3]。有研究表明，必需脂肪酸摄入不足可能会增加ASD的发病风险，母孕期补充ω-3不饱和脂肪酸能降低ASD的发病风险[4]。但ω-3不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的补充却不能改善ASD患儿的临床症状[5]。提示必需脂肪酸在ASD发病中的作用尚存在学术争议[6]。动物模型研究发现，脂肪酸合成代谢可能参与ASD的发病[7]。由于中国尚缺乏人脑组织库，本研究以国外尸体ASD儿童的小脑组织及国内ASD儿童为研究对象，探讨脂肪酸代谢在ASD中的作用及其与ASD症状严重程度的相关性，为寻找ASD的生物标志物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：孤独症组儿童的小脑组织[美国发育障碍患者脑和组织库(Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders，BTBDD)]8例，男5例，女3例，年龄4～14岁，平均年龄(9.1±3.4)岁；死后间隔时间9～24 h，平均(15.1±4.8)h；儿童孤独症评定量表(Childhood Autism Rating Scale，CARS)得分32～58分，平均(41.4±8.4)分。对照组儿童的小脑组织[美国国家儿童保健和人类发育研究所(National Institute of Child Health and Human Development，NICHD)]共入组8例，男5例，女3例，年龄4～14岁，平均年龄(8.4±3.7)岁；死后间隔时间10～21 h，平均(16.8±3.4)h；CARS得分15～21分，平均(16.5±1.8)分。CARS量表的评分标准：<30分，无孤独症；30～36分，轻、中度孤独症；37～60分，重度孤独症。两组研究对象均需排除脆性X综合征或其他广泛发育障碍，强迫症、情感障碍或其他神经精神疾病，神经系统变性疾病、脑外伤或脑血管病。两组的年龄、性别及死后间隔时间无显著差异。两组儿童的小脑组织标本用于Western blot检测。该组研究经纽约州立基础研究院审核通过，所有上述研究对象均已签署知情同意书。

2018年9月至2019年8月在本院确诊为孤独症的患儿60例为研究组，以同期来本院常规咨询但未诊断为任何精神疾病的健康儿童36名为对照组。所有孤独症患儿均符合美国精神障碍诊断与统计手册第五版(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disordres，Fifth Edition，DSM-V)孤独症谱系障碍的诊断标准。本研究共纳入孤独症患儿60例，男39例，女21例，年龄3～14岁，平均年龄(7.3±3.2)岁；纳入对照组36名，男24例，女12例，年龄3～15岁，平均年龄(7.3±3.1)岁。两组儿童年龄和性别无显著差异。两组儿童的外周血标本用于ELISA检测。本组研究通过上海市精神卫生中心伦理委员会批准(文号：2018-43)，所有研究对象均已签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂：脂肪酸代谢酶抗体试剂盒(Cell Signaling Technology公司)：包含兔单克隆抗体脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coA-carboxylase，ACC)、乙酰辅酶A合成酶1(acetyl coenzyme A synthetase 1，AceCS1)、长链脂酰辅酶A合成酶1(long-chain acyl -coenzyme A synthetase 1，ACSL1)和β-actin，抗兔IgG(anti-rabbit IgG，HRP linked antibody)等；BCA 法蛋白浓度测定试剂盒(Thermo Fisher公司)；SDS-PAGE 凝胶试剂盒(BioRad公司)；ELISA试剂盒：FASN、ACSL1和AceCS1(Biocompare公司)、ACC(Cell Signaling Technology公司)等。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质印迹(Western blot)检测小脑组织中脂肪酸代谢酶蛋白含量：首先配置匀浆缓冲液；其次把新鲜冰冻小脑组织制备成脑组织匀浆；再进行BCA蛋白浓度测定，制胶、上样、电泳、转膜、封闭和抗体孵育，最后在暗室中显影鉴定。

1.2.2 酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血中脂肪酸代谢酶含量：研究对象于就诊当日静脉采血4 mL，室温静置2 h，1 000×g离心20 min，分离血清。根据ELISA试剂盒说明书分别进行检测。大致步骤为：先将标准或样品加入96孔板中，孵化并移除；再加入特异性的检测抗体，孵育和洗涤；然后加入酶结合物，孵育和洗涤；最后加入终止液，立即在酶标仪的450 nm处测量A值，根据标准曲线计算结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 孤独症尸体小脑中脂肪酸代谢酶系的蛋白表达水平与孤独症严重程度的相关性分析

孤独症组小脑组织中ACC和FASN的蛋白表达显著升高(P<0.05)，而AceCS1和ACSL1无显著变化(图1)。孤独症组小脑组织中FASN、ACC、ACSL1及AceCS1的蛋白表达均与CARS量表评分呈显著正相关(P<0.01)(表1)。

2.2 孤独症患儿外周血中脂肪酸代谢酶的含量及与孤独症严重程度的相关性分析

孤独症患儿外周血中ACC和FASN的含量明显高于对照组(P<0.01)，而AceCS1和ACSL1无显著变化(表2)。孤独症组儿童外周血中FASN、ACC、ACSL1及AceCS1的含量均与CARS量表评分呈显著正相关(P<0.01)(表3)。

3 讨论

本研究发现，孤独症小脑及血清中均存在脂肪酸代谢酶ACC和FASN的表达增加，其中ACC是脂肪酸合成的关键酶，且这一步骤的反应制约着脂肪酸合成过程中第一阶段的速度，ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低[8]。

A.Western blot analysis of five markers, FASN, ACC, ACSL1, AceCS1 and β-actin, in the cerebellum specimen from non-autism controls and autism patients; B.relative expression of FASN, ACC, ACSL1 and AceCS1 levels between the autism and control groups;*P<0.05 compared with the control group

图1 脂肪酸代谢酶系在孤独症组和对照组小脑组织中的表达情况
Fig 1 Expression of fatty acid metabolic enzymes in the cerebellum specimen of autism group and control group

表1 孤独症组小脑组织中脂肪酸代谢酶系蛋白表达水平与孤独症严重程度的相关性

*P<0.01 compared with control.

表2 孤独症患儿外周血中脂肪酸代谢酶含量

*P<0.01 compared with control group.

表3 孤独症组外周血中脂肪酸代谢酶系含量与孤独症严重程度的相关性

*P<0.01 compared with control group.

FASN是脂肪酸从头合成的关键酶，是一个具有多种功能的酶系统，相比脂肪酸从头合成过程中的其他酶，FASN是唯一只作用于脂肪酸合成路径而不会影响到其他代谢过程的酶[9]。因此，ACC和FASN的表达增加提示孤独症可能存在脂肪酸合成的增加。本研究还发现，ASD中ACC、FASN、ACSL1和AceCS1的表达水平与CARS量表评分呈显著正相关，CARS得分高者ACC、FASN、ACSL1和AceCS1的水平也高，这也提示未来可能通过检测脂肪酸代谢酶的含量高低来预测孤独症症状的严重程度。

与本研究不同的是，有学者认为ASD患者血液中的长链多不饱和脂肪酸水平显著降低，给ASD患者补充ω-3多不饱和脂肪酸可能有助于改善ASD的核心症状，且孕妇摄入ω-3多不饱和脂肪酸的量与后代ASD的发病风险呈显著负相关，摄入量越高，后代患孤独症的风险越低[10-11]。相反，也有研究认为，ω-3多不饱和脂肪酸的补充并不能改善ASD的临床症状[12]。这些研究结果不同的原因可能在于饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸在孤独症发病中的作用不同。

综上所述，ASD中ACC和FASN的表达水平高于正常对照，而且，ASD症状越重，ACC、FASN、ACSL1和AceCS1的表达水平越高。脂肪酸合成代谢异常可能是ASD的发病机制之一，将来可能在此基础上探索出具有诊断和监测价值的生物标志物，用于指导ASD的临床诊断和治疗。然而，由于本研究中的脑组织样本来源于国外组织库，且样本量小，没有进行种族划分，暂时无法对不同种族ASD患者的小脑组织样本进行分析，将来会扩大样本量及细分种族等指标进行下一步的研究。