敲除ARID1A对人肝癌细胞系PLC/PRF/5基因表达调控的影响

王町町，梁俊波，王晓月

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系，北京 100005)

SWI/SNF染色质重塑复合物在染色质结构的表观遗传调控和基因表达中具有重要作用，可通过改变基因表达驱动肿瘤的发生发展[1]。基因组学研究显示，超过20%的癌在SWI/SNF复合物中至少有一个亚基突变[2]，其中ARID1A亚基突变频率最高[3]，包括子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌和结直肠癌等。

作为SWI/SNF染色质重塑复合物的重要组成部分，ARID1A基因突变被认为是多种肿瘤发生的驱动因素，与多种肿瘤的不良预后相关。前期研究显示，ARID1A可通过多种机制影响肿瘤的发生发展，如调控增强子活性[4]、调节细胞周期和DNA损伤检查点[5]、与p53相互作用调控p53下游靶基因表达[6]、负调节TERT转录活性[7]等。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ARID1A敲除细胞系并通过全转录组测序技术(RNA-seq)鉴定ARID1A敲除后对基因表达调控的作用，为进一步阐明ARID1A在肿瘤发生发展中的作用机制提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞系PLC/PRF/5(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；lentiCRISPR v2载体(Addgene公司)；gRNA序列(苏州泓迅生物科技有限公司合成)；Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen公司)；DMEM高糖培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；FastDigest BsmBI、T4 PNK(Thermo Scientific公司)；T4 DNA Ligase(NEB公司)；2×TransStart FastPFU PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)；质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒(上海天根生化科技有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 敲除ARID1AsgRNA质粒的构建：利用sgRNA在线设计网站针对ARID1A蛋白编码区的sgRNA，sgRNA序列如下：5′-CCTGTTGACCATACCC GCTG-3′；将sgRNA的两条oligo退火和磷酸化后连接到BsmBⅠ酶切的lentiCRISPR v2载体上，转化至大肠杆菌，挑单克隆进行Sanger测序，提取成功连接sgRNA的质粒。

1.2.2 PLC/PRF/5ARID1A敲除细胞系的构建：使用Lipofectamine 3000将sgRNA质粒转染PLC/PRF/5细胞，加入最低致死剂量的puromycin筛选出成功转染的细胞，然后使用流式细胞仪进行单克隆分选并扩大培养。

1.2.3 Sanger测序鉴定ARID1A基因型：提取扩大培养的单克隆细胞和PLC/PRF/5ARID1A野生型细胞的基因组DNA，PCR扩增ARID1AsgRNA附近基因组序列，将单克隆细胞PCR产物连T载转化后挑单克隆进行Sanger测序。

1.2.4 Western blot检测ARID1A蛋白表达：用RIPA裂解液裂解扩大培养的单克隆细胞和PLC/PRF/5ARID1A野生型细胞、BCA法蛋白定量。将制备好的蛋白样品进行上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育和ECL显影。

1.2.5 RNA-seq样品制备与高通量测序：将PLC/PRF/5ARID1A野生型(ARID1AWT)和敲除型(ARID1AKO)细胞分别铺于3个6 cm细胞培养皿中，待细胞汇合度至70%左右时，用Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA，送北京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组建库及高通量测序。

1.2.6 RNA-seq数据预处理：使用FastQC对RNA-seq测序数据进行质量控制，然后用HISAT2和StringTie软件估算基因表达量[8]。

1.3 统计学分析

1.3.1 主成分分析：使用R语言princomp函数对PLC/PRF/5ARID1AWT和KO细胞的基因表达量进行主成分分析，用于反映样本聚类情况。

1.3.2 差异表达基因筛选：使用DESeq2[9]对PLC/PRF/5ARID1AWT和KO细胞RNA-seq count data进行差异表达分析，并使用pheatmap对差异表达基因进行聚类分析。筛选表达上调差异基因的标准是：log2(fold-change)>1且padj<0.05；筛选表达下调差异基因的标准是：log2(fold-change)<-1，且padj<0.05。

1.3.3 GO功能富集分析：将差异表达基因列表提交到metascape数据库[10](http://metascape.org)进行GO功能富集分析。

2 结果

2.1 PLC/PRF/5 ARID1A敲除细胞系的鉴定

Sanger测序结果显示，与野生型细胞相比，敲除组sgRNA靶位点附近ARID1A序列均发生碱基插入或缺失，共包含3种类型：20 bp deletion、2 bp insertion和98 bp insertion(图1A)。

Western blot结果显示，与野生型细胞相比，敲除组未检测到ARID1A蛋白表达(图1B)。

2.2 RNA-seq样本相关性与聚类

PLC/PRF/5ARID1AWT和KO细胞的3个重复分别聚为一类，表明野生型细胞与敲除型细胞各自样品的重复性较好，前期实验处理具有较好的一致性和可靠性。此外，根据基因表达量可将ARID1AWT和KO细胞分为两类，表明两株细胞间基因表达存在显著差异(图2)。

2.3 差异表达基因分析结果

ARID1AKO细胞与PLC/PRF/5ARID1AWT细胞相比，ARID1AKO细胞共筛选出978个差异表达基因，包括480个表达上调差异基因和498个表达下调差异基因(图3)。

通过差异表达基因聚类热图可更为直观的反应差异表达基因在ARID1AWT和KO细胞间的差异表达情况(图4)。

2.4 GO功能富集分析

ARID1A敲除后差异表达基因主要富集在细胞黏附、激素水平调节、细胞形态发生、阴离子转运、对外界刺激反应的负调控、突触组织、MAP激酶活性调控和激素代谢等生物学过程(图5)。

3 讨论

本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术和RNA-seq技术研究了ARID1A敲除后对肝癌细胞系PLC/PRF/5基因表达调控的影响。首先，利用CRISPR系统成功构建了PLC/PRF/5ARID1A基因敲除细胞系。然后，通过对两组细胞的RNA-seq分析筛选出978个差异表达基因，包括480个表达上调差异基因和498个表达下调差异基因，表明ARID1A在PLC/PRF/5肝癌细胞中可调控大量基因的表达。

图1 Sanger 测序 (A)和Western blot (B)检测 PLC/PRF/5 ARID1A敲除Fig 1 Validate ARID1A knockout efficiency by Sanger sequencing (A) and Western blot (B) in PLC/PRF/5 cells

图2 RNA-seq主成分分析图Fig 2 Principal component analysis of differential RNA-seq samples

图3 差异表达基因火山图Fig 3 Volcano plot for differentially expressed genes from RNA-seq profile

图4 差异表达基因聚类热图Fig 4 Heat map for differentially expressed genes from RNA-seq profile

图5 差异表达基因GO富集分析Fig 5 GO enrichment analysis for differentially expressed genes

GO功能富集分析显示ARID1A缺失后影响激素水平调节和激素代谢，这与以往研究相符[11]。但目前尚不清楚ARID1A在激素调节中的作用是否与肿瘤的发生发展相关。

已有证据表明，ARID1A表达降低或缺失可促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[12]。本研究中，GO功能富集分析显示，差异表达基因首要富集在细胞黏附通路，而细胞黏附与肿瘤的侵袭和迁移密切相关，这一结果再次提示ARID1A在肿瘤的侵袭和迁移中具有重要作用，也可从一定程度上解释ARID1A参与肿瘤侵袭和迁移的潜在机制。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是细胞内一类丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、侵袭和转移中具有重要作用[13]。MAPK激活主要依赖两种方式： 1)经典MAPK激活通路：即MAPK激酶激酶(MAP kinase kinase kinase, MAP3K)-MAPK激酶(MAP kinase kinase, MAP2K)-MAPK级联激活；2)非经典MAPK激活通路：依赖PAK等激酶激活。MAPKs的失活主要通过双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase，DUSP)的去磷酸化实现。本研究发现，ARID1A缺失后有33个差异表达基因显著富集在MAPK活性调控信号通路，占所有差异表达基因数目的4.13%，主要包括MAP3K5、MAP2K6、DUSP4、DUSP8和PAK3等基因。该发现提示，在PLC/PRF/5肝癌细胞中ARID1A可能通过影响MAPK的活性参与肿瘤的发生发展。

综上所述，本研究以ARID1A基因敲除人肝癌细胞系PLC/PRF/5为模型，通过RNA-seq鉴定了受ARID1A调控的基因，为进一步研究ARID1A在肝癌发生发展中的作用机制提供了新的线索。