第28届国际生物学奥林匹克竞赛试题实验2·生物化学

2020-04-15 09:36佟向军王戎疆张雁云范六民

生物学通报 2020年5期

关键词：丙酮酸底物红细胞

佟向军王戎疆张雁云杜军范六民

（1 北京大学生命科学学院北京 100871 2 北京师范大学生命科学学院北京 100875 3 中国人民大学附属中学北京 100080）

总分：78 分时间：120 min

本实验考试包含3 个问题，请按照下述顺序完成实验：

问题1:分析血液标志物（11 分）。本实验约耗时15 min,将提供一些数据请你分析。

问题2：动力学参数的实验测定（60 分）。本实验约耗时90 min，你将得到自己的实验结果。

问题3：遗传标记分析（7 分）。本实验约耗时5 min，将提供一些数据请你分析。

本考试中，你将通过血液标志物、酶动力学和一种遗传病的家族遗传分析一位病人的病史。

重要信息：

●在给定的框中写下你的姓名、学生代码和国家；

●请在答题纸上填写答案，这样才能得分；

●确定已收到列出的所有材料和设备；如果缺少任何物品，请立即举绿牌示意；

●实验过程中，请确保正确操作设备；由于自己的原因不慎洒出液体或损坏设备，将不予补充；

●在考试结束哨声响起时，请立即停笔；

●考试结束后，请将答题纸留在桌子上；

●不得将纸张、材料或设备从实验室带出；

●英文原件可应要求提供。

材料：冰盒；溶液A：2×溶液的反应母液，含有：50 mmol／L 磷酸钾缓冲液，pH=7.6；14 mmol／L MgSO4；2.64 mmol／L ADP；40 U 乳酸脱氢酶；0.4 mmol／L NADH （10 mL）（在冰盒里）；溶液B：H2O（10 mL）；溶液C：10 mmol／L 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）溶于0.1 mol／L 磷酸钾缓冲液，pH=7.6（1.5 mL）（在冰盒里）；血浆稀释液F、M 和D（每个0.5 mL）（在冰盒里）；1 支20～200 μL 移液器；1 支100～1 000 μL 或200～1 000 μL 移液器；适合移液器的吸头；1 mL 塑料比色皿（1 cm 光程）×20；盛放废弃吸头和比色皿的垃圾桶；1 台可见光分光光度计；查阅分光光度计的说明书（另外的单独文件），将指导你使用分光光度计；置于样品室的1 个比色皿以指示正确的方向；1 个比色皿架；方形封口膜×30；数字式计时器；30 cm 尺子；计算器；钢笔；铅笔。

重要背景信息：丙酮酸激酶（PK）是一种58 kDa 的蛋白，以同源四聚体的形式起作用，在糖酵解途径中起关键作用（图1）。在反应中，将其底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸和ATP。

PK缺乏症（PKD）是遗传性非球形细胞溶血性贫血的最常见原因，是一组与红细胞净损失相关的遗传性疾病。在PKD 病症中，红细胞在成熟前裂解（经历溶血），导致红细胞不足（贫血）。在遗传性非球形细胞溶血性贫血中，红细胞不像其他形式的溶血性贫血呈现球形。血液分析也有助于了解PKD疾病。此外，该疾病通常与网织红细胞增多症（即未成熟红细胞——网织红细胞数量增加）有关。

PKD遗传于常染色体隐性模式。具有常染色体隐性病症个体的父母可能会或不会显示病情的体征和症状，取决于他们拥有的等位基因。

假定亚基表达量相同且随机关联，简单杂合子或复合杂合子（杂合子中有2 个不同的隐性等位基因）中，PK 四聚体同工酶（A4，A3B，A2B2，B3A，B4）的理论比值为1∶4∶6∶4∶1。如果B 是变体，A 是正常的，则PKD 患者体内所有PK 四聚体中约94%含有一个或多个突变的亚基；未组装的单体易被蛋白酶降解。重要的是，要注意一些特定的等位基因编码的PK 蛋白形成四聚体，而其他等位基因编码的PK 蛋白则保持单体形式。

通常在简单杂合子、复合杂合子和纯合子中观察到的临床症状是可变的，从需要输血的新生儿黄疸，到能自我调节、只显示最小临床症状的溶血性贫血。根据有缺陷酶的生物化学特征，已经鉴定了许多突变型PK。

图1 丙酮酸激酶的功能

临床情境：已诊断出很多家庭成员患有非球形细胞溶血性贫血，可能与PK 缺乏有关。可进行许多测试，包括血液测定以确定血液组成的参数（血液图）和专门用于PK 活性的血浆酶分析。此外，可进行遗传分析，包括鉴定个体的PK 蛋白，以及通过家系分析确认可能的遗传模式。

你将分析和收集3 名家庭成员的数据：父亲（F）、母亲（M）和女儿（D），以确定家系。

问题1：血液分析

从父亲（F）、母亲（M）及其女儿（D）收集全血样本。取血并分析后，获得以下这部分结果（表1）。

表1

可进行各种分析，包括测定血细胞比容，即红细胞堆积的体积占总血量的百分比。通过将血液样品吸入微量毛细管并离心，使红细胞沉淀在一起，再通过测量毛细管中堆积在一起的红细胞占总体积的比值，计算红细胞的百分比。

任务1a

确定图2所示的每个人的血细胞比容（堆积的红细胞占总体积的百分比）。将这些数据填写在表3的第1 行中,以百分比表示,小数点后保留1 位有效数字。

图2 父亲、母亲及女儿的血细胞比容图

表2 健康人的血液图正常值

任务1b

使用图2的堆积细胞体积和表1的患者数据，计算每位患者（F、M 和D）的以下参数：红细胞体积，称为平均细胞体积（MCV）；每个红细胞血红蛋白的质量，称为平均细胞血红蛋白（MCH）；MCV 以飞升（fL，1 fL=1×10-15L）为单位，小数点后保留1 位有效数字；MCH 以皮克（pg，1 pg=1×10-12g）为单位，小数点后保留1 位有效数字；MCHC 是RBC 这部分中血红蛋白总浓度，以克/分升（g／dL，1 dL=0.1 L）为单位，小数点后保留1 位有效数字。

请在方框1 中填写计算所得父亲（F）的每个参数值，并在表3中填写父亲（F）、母亲（M）和女儿（D）各参数的相应数字。

方框1 患者F（父亲）的计算结果（4 分）

表3（4 分）

进一步分析：根据红细胞的大小，将贫血症分为正常细胞（正常MCV）、大细胞（增加的MCV）或小细胞（降低的MCV）贫血。基于外周全血涂片检查，小细胞贫血也常被描述为低血色素贫血。小细胞小而薄的光学性质，使其在血涂片上显示为低着色，而血红蛋白浓度保持在正常范围（小细胞贫血；低色素性贫血）。正常血色素血液的血涂片无光学性质的变化，血红蛋白的浓度也在正常范围。

表2提供了MCV 和MCHC 的正常范围。

任务1c

使用你获得的数值（包括在表3中），根据血细胞的大小及样品F、M 和D 的血液中血红蛋白水平进行分类。

对每位患者，请从以下选项中选择其一回答（注意：任何选项均可多次使用）：

A．大红细胞，正常色素

B．小红细胞，低色素

C．正常细胞，正常色素

（3 分）

问题2：测定丙酮酸激酶活性

利用生物化学方法，通过研究酶的动力学变化，可了解酶的性质。酶活性通常通过监测底物的消失或产物的产生进行确定，通常使用反应混合物的分光光度特性的变化确定底物和产物的变化。

通过耦联测定方便地测定PK，其中反应产物丙酮酸（方程式1）用作NADH 耦联的乳酸脱氢酶（LD）（方程式2）的底物。该酶以足够的量加入到反应混合物中，使反应期间产生的所有丙酮酸转化成乳酸。可通过340 nm 光吸收值随时间的减小监测反应。耦联反应的反应方程式见图3。

图3 丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LD）催化的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）（方程式1）和丙酮酸（方程式2）的分解

可通过改变PEP 底物浓度确定酶的动力学性质（方程式1）。

实验目的：确定3 位患者，父亲（F）、母亲（M）和女儿（D）血浆样本中PK 的功能。

●通过使用耦联测定法测定患者血浆样品中PK 的活性。

●计算PK 的动力学性质，以绝对单位表示。

方法:丙酮酸激酶测定开始前,请注意以下事项：

1）溶液A、C 和患者样本F（父亲）、M（母亲）、D（女儿）应保持在冰上，溶液B（H2O）保持在室温。

2）分光光度计应该在340 nm 波长处使用水（已提供）做空白对照。

3）通过表4所示的试剂，直接吸取至1 mL的塑料比色皿中制备反应混合物。你应该添加除血浆样品以外的所有成分，然后在准备开始反应时，最后添加血浆样品。

表4 丙酮酸激酶实验试剂

任务2a

计算5 个浓度的PEP（溶液C）（从0.2～1.5 mmol／L中选取5 个浓度）所需PEP 的反应体积。在方框2 中填写最高浓度的计算示例。PEP 将推动反应进行,以测定每个血浆样品［父亲（F）、母亲（M）和女儿（D）］中的丙酮酸激酶活性。

方框2（1 分）

任务2b

将用于使反应混合的体积填入表5中的空白处；注意：对于每个血浆样品（F、M 和D）都相同。

你应该在表5每一列的顶部填写上你决定用的底物浓度PEP［S］，以及在各相应框中填写每个溶液所用的体积。

表5 反应体积（3 分）

PK 活性测定

通过反复颠倒比色皿混合内容物（确保使用拇指或食指将一块封口膜压紧在开口处），在零时间点读取A340读数，然后以30 s 的间隔记录A34090 s。记录下分光光度计上显示的吸光值。

对于每个样品，需要确定你使用各浓度PEP（［S］）时的初始反应速率ΔA／Δt（时间以min 表示），用零时间点值和另一个选择的数值。在数值上画圈以突出显示你用于计算速率的时间点范围。

任务2c

按所描述进行实验，并使用提供的表记录吸光度读数（表6.1、6.2 和6.3）。

动力学参数计算：随着时间的推移，产物/底物浓度的变化可通过吸光度的变化表示。对于每个初始速率ΔA／Δt，计算每个PEP 底物浓度（［S］）的反应初始速度V0（ΔConc／Δt）。反应用Beer-Lambert定律给出速度绝对单位应为μmol／min。Beer-Lambert 定律（或Beer 定律）是吸光物质的吸光度和浓度之间的线性关系。公式为：A=εlc，其中A为光吸收，ε为摩尔消光系数，l为光程，c为浓度。

该实验测量NADH［摩尔消光系数为6 220 L／（mol·cm）］向NAD+（其在340 nm 具有可忽略的吸光度）的转化，即PEP 向乳酸的转化。由于组分摩尔比为1∶1，因此，NADH 的转化率等于PEP 的转化率。比色皿光程长度为1 cm。

任务2d

计算初始速度（V0），将每个病人［父亲（F）、母亲（M）和女儿（D）］的答案填入下表（表7.1、7.2和7.3），保留3 位小数。

表6.1 样品F（6 分）

表6.2 样品M（6 分）

表6.3 样品D（6 分）

表7.1 患者F（1 分）

表7.2 患者M（1 分）

表7.3 患者D（1 分）

计算酶参数KM和Vmax

通过不同底物浓度的不同酶促反应速率，可确定2 个酶参数：KM和Vmax。这2 个参数可通过以下2 种方法之一进行估算：Michaelis-Menten 图（图4A）或Hanes-Woolf 图（图4B）。

图4 动力学数据图

任务2e

使用你从每位患者（F、M 和D）获得的数据，在下面的坐标纸上，以V0对［S］各做一张Michaelis-Menten 图。你应该将3 个数据图绘制在一张坐标纸上：父亲（F）、母亲（M）和女儿（D）各一个数据图。用“×”标记来自父亲（F）的数据，用“○”标记来自母亲（M）的数据，用“△”标记来自女儿（D）的数据。