钙盐沉淀法从酮酸发酵液中提取α-酮戊二酸

彭小雨， 曾伟主， 周景文， 徐国强*

（1. 江南大学 生物工程学院， 江苏 无锡 214122；2. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室， 江苏 无锡214122； 3.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡214122）

α-酮戊二酸（α-KG）作为重要的二元羧酸，参与微生物体内的碳氮代谢，并在整个碳氮代谢过程中起着至关重要的作用[1-2]；在食品、制药、化学以及动物饲料等行业具有广泛的应用[3-4]。丙酮酸（PA）又称2-氧代丙酸，是最重要的氧代羧酸之一[5-6]，参与细胞体内的能量代谢，并在其中扮演着极其重要的角色。 目前，化学合成法因生产成本高，环境污染严重等缺点逐渐被无污染的生物发酵法所取代。 本实验室在2010 年筛选出了一株以甘油为碳源并过量积累α-酮戊二酸的菌株（Yarrowia lipolytica WSHZ06），利用此菌株生产α-酮戊二酸，产量高达39.2 g/L，但是丙酮酸的产量却高达16.8 g/L[7]。 为了能够减少丙酮酸的积累，同时又能够过量积累α-酮戊二酸，研究人员采取了代谢改造[8-9]和过程优化[10-11]等策略来达到这一目标，但是丙酮酸积累的问题依然存在。 酮酸联产为整个实验提供了一个新的思路。在前期工作中本研究室对于发酵优化联产酮酸已经达到很好的效果，α-酮戊二酸和丙酮酸的产量分别高达67.4 g/L 和39.1 g/L[12]。

由于α-酮戊二酸和丙酮酸的化学性质和物理性质较为相似，一般常用的分离提取方法无法将两者进行有效的分离。 Pal 等对于反应萃取法的研究比较多，先后采用了不同的单一萃取剂（磷酸三丁酯[13]，三辛胺[14]，三丁胺[15]）和混合萃取剂（磷酸三丁酯，三辛胺，季胺氯化物）来分离发酵液中的丙酮酸[16]。但是大量的有机溶剂的使用以及复杂的操作程序也限制该方法在工业上的广泛应用。 在2013 年，占宏德等通过筛选多种不同类型的交换树脂发现，D301 树脂为分离α-酮戊二酸的最佳吸附树脂，并且通过阶段洗脱的策略，使α-酮戊二酸的收率达到了93.2%[17]。 李斌水等采用氯化钙沉淀发酵液中的α-酮戊二酸[18]，但是发酵液中会出现大量游离的Cl-，Cl-对金属容器腐蚀性较强且成本高，在工业上大规模应用受到制约。 王东阳等采用氢氧化钙来沉淀发酵液中的α-酮戊二酸[19]，氢氧化钙和α-酮戊二酸沉淀结合较少，收率较低。而本文中主要对比了3 种不同钙盐（CaCl2，CaCO3和Ca（OH）2）对发酵液中酮酸的影响，最后建立一种有效分离发酵液的α-酮戊二酸的钙盐沉淀方法。 并对分离提取过程工艺进行了探索，希望能为酮酸的提取和纯化提供理论参考。

1材料与方法

1.1 试剂与仪器

丙酮酸和α-酮戊二酸标品，购于上海国药集团有限公司；浓硫酸、CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2等均为国产分析试剂。 酮酸发酵液：由本实验室发酵所得（菌株：Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3），含有44.68 g/L的α-酮戊二酸和36.93 g/L 的丙酮酸。

恒温培养箱：上海医疗器械研究所产品；恒温摇床： 上海精密仪器仪表有限公司产品；15 L 发酵罐：迪必尔生物工程有限公司产品；台式高速离心机：德国艾本德公司产品；pH 计：瑞士梅特勒-托利多公司产品；Agilent 1260 高效液相色谱仪：美国安捷伦公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液的预处理 根据Zhou 的发酵方法[7]，利用解脂亚洛酵母WSH-Z06 C3 发酵生产酮酸，待发酵结束后， 将酮酸发酵液在8000 g 的条件下离心20 min，去除沉淀物，收集上清液。 然后通过纳滤膜仪器除去上清液中的大分子物质相对分子质量（＞500），如蛋白质、色素。 备用。

1.2.2 钙盐沉淀法分离α-酮戊二酸 配制50 g/L的α-酮戊二酸标准溶液， 取50 mL α-酮戊二酸水溶液，加入等摩尔质量的钙盐固体。 待固体完全溶解后，用质量分数为50%的Ca（OH）2缓慢调节pH至3 个梯度：6.0、6.5 和7.0。沸水浴加热至上清液澄清（15 min），抽滤，量取滤液体积，高相液相色谱法（HPLC）检测滤液中α-酮戊二酸的含量。

1.2.3 钙盐沉淀法分离丙酮酸 配制50 g/L 的丙酮酸标准溶液，取50 mL 丙酮酸水溶液，加入等摩尔质量的钙盐固体。 待固体完全溶解后，缓慢加入质量分数为50%的Ca（OH）2使溶液的pH 在6.0～7.0之间。 沸水浴加热至上清液澄清（15 min），抽滤，量取滤液体积，HPLC 检测滤液中α-酮戊二酸的含量。

1.2.4 数据计算方法

式中：R1，样品的最终回收率，%；m1，烘干后的钙盐沉淀质量，g；ρ， 初始酮酸质量浓度，g/L；V， 初始体积，mL；P2，样品的最终纯度，%；F标样，HPLC 检测标样峰面积；F试样，HPLC 检测试样峰面积；m标样，标样质量，g；m试样，试样质量，g。

1.2.5 HPLC 分析 取1 mL 滤液于8000 g 离心5 min， 将上清液稀释适当的倍数， 然后经0.22 μL水系滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。 色谱分析条件根据参考文献[7]。

1.2.6 钙盐的检测 取6 管5 mL 发酵液离心，去除上清液。 将离心后的菌体水洗2 次后， 向其中3管中加入2 mL 2 mol/L HCl， 另外3 管中加入等体积的水，充分混匀后，离心取上清液。 HPLC 检测上清液中α-酮戊二酸的含量。

2结果与讨论

2.1 钙盐沉淀法分离α-酮戊二酸

2.1.1 不同钙盐沉淀对α-酮戊二酸分离的影响分别以CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2为沉淀剂，考察了在3 个pH 梯度（6.0、6.5、7.0）下α-酮戊二酸的回收率，结果如表1 所示。 由表1 可知，以CaCl2为沉淀剂时，随着pH 值的增加，滤液中的α-酮戊二酸呈下降趋势， 但是α-酮戊二酸的回收率呈上升趋势。在pH 6.5 时，α-酮戊二酸的收率达到最高，为98.05%。故选用6.5 作为CaCl2沉淀的pH。以CaCO3为沉淀剂时，α-酮戊二酸的收率并不是随着pH 值的上升而呈上升趋势。 在pH 6.5 时，α-酮戊二酸的收率达到最高， 为96.84%。 故选用6.5 作为CaCO3沉淀的pH。 以Ca（OH）2为沉淀剂时，Ca（OH）2沉淀时pH 影响不大， 在pH 7.0 时，α-酮戊二酸的收率达到最高，为96.58%。 故选用7.0 作为Ca（OH）2沉淀的pH。

表1 不同钙盐的沉淀结果Table 1 Precipitation capacity of different calcium salts

2.1.2 α-酮戊二酸钙盐酸化过程参数的确定 量取200 mL 水， 然后加入不同质量的α-酮戊二酸固体，使α-酮戊二酸的浓度分别为50、100、150、200 g/L。表2 所示显示了不同质量浓度下所对应的α-酮戊二酸的pH。 如表2 可明显的观察到，溶液中有机酸的质量浓度和有机酸的pH 呈正相关。 当质量浓度均达到300 g/L 时，此时溶液pH 为0.93，故酸化α-酮戊二酸钙沉淀过程中可以尽可能提高α-酮戊二酸质量浓度。 但为了完全地置换出α-酮戊二酸，溶液pH 应该调节至低于该质量浓度α-酮戊二酸的实际pH 值。 溶解沉淀物时加入水的体积为酮戊二酸钙湿重的1～1.5 倍。

表2 不同质量浓度有机酸的pH （25 ℃）Table 2 pH values of different organic acid concentrations（25 ℃）

2.1.3 α-酮戊二酸钙盐的纯化 前期实验已经探索了3 种不同的钙盐沉淀法对α-酮戊二酸的影响，结果发现CaCl2对α-酮戊二酸沉淀效果最好，收率接近98%。然而向发酵液中加入CaCl2后，发酵液中会出现大量游离的Cl-，Cl-对金属容器腐蚀性较强且成本高，在工业上大规模应用受到制约。 考虑到CaCO3和Ca（OH）2的沉淀效果相差不大，继续考察CaCO3和Ca（OH）22 种钙盐的纯化效果。

在高质量浓度α-酮戊二酸条件下，应用CaCO3和Ca（OH）2都会使溶液呈糊状，α-酮戊二酸在质量浓度为150 g/L 左右时已十分浓稠，α-酮戊二酸经过CaCO3和Ca（OH）2沉淀和酸化后的得率分别为84.52%和85.19%。 两者沉淀出的酮戊二酸钙固体颜色不同，CaCO3沉淀出的固体为白色，Ca（OH）2沉淀出的为淡黄色。 酸化后溶液颜色如图1 所示，应用Ca（OH）2进行沉淀处理后的α-酮戊二酸溶液颜色深， 应用CaCO3进行沉淀处理后的α-酮戊二酸溶液颜色较浅。 HPLC 检测结果如图2 所示，酸化后的溶液，α-酮戊二酸纯度分别为：99.18%（CaCO3）和96.78% （Ca（OH）2），结果表明CaCO3是更适合沉淀α-酮戊二酸的钙盐。

图1 标液沉淀后过滤图Fig. 1 Graph of α-ketoglutaric acid model solution after precipitation

图2 标液沉淀后过滤液HPLC 检测Fig. 2 HPLC chromatogram of α-ketoglutaric acid model solution after precipitation

以CaCO3为沉淀剂，按照标液沉淀分离纯化的过程来验证分离发酵液中α-酮戊二酸。结果显示α-酮戊二酸的收率和纯度分别为82.5%和98.89%。 说明钙盐沉淀法适用于分离发酵液中的α-酮戊二酸。

2.2 钙盐沉淀法分离丙酮酸

分别以CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2为沉淀剂，考察了在pH 6.5 丙酮酸的沉淀效果， 结果如图3 所示。 由图3 可知，丙酮酸溶液澄清透明，说明钙盐沉淀法不适用于丙酮酸的分离提取。

图3 丙酮酸沉淀结果Fig. 3 Graph of pyruvic acid model solution after precipitation

2.3 钙盐沉淀法分离发酵液中酮酸

钙盐沉淀法可较好沉淀分离α-酮戊二酸，而无法沉淀丙酮酸，考察该方法是否可用于联产酮酸的分离。取50 mL 预处理后的发酵液，缓慢加入CaCO3固体，调节pH 至6.5，煮沸20 min，过滤，HPLC 检测过滤液中有机酸的含量。结果表明α-酮戊二酸的收率为93.42%，但过滤液中丙酮酸相对含量明显降低，并存在大量的杂质。 如图4 所示。

由于丙酮酸稳定性差， 沉淀过程中的高温、偏中性条件可能对丙酮酸有影响，故对这2 个因素进行验证试验。

图4 发酵液沉淀后过滤液HPLC 检测Fig. 4 HPLC chromatogram of fermentation broth after precipitation

2.4 丙酮酸稳定性分析

2.4.1 温度的影响 配制50 g/L 的丙酮酸的标准溶液，分别取10 mL 于试管中，加入一定量碳酸钙，Ca（OH）2调节pH 至6.5，分别置于0、20、30、40、60、80、90 ℃条件下20 min。上清液稀释50 倍后，HPLC检测丙酮酸相对含量（峰面积表示）。 结果如图5 所示。 由图5 可知，在0～90 ℃之间，随着温度的升高，丙酮酸的峰面积有所下降，但是效果不明显，所以说温度对丙酮酸的稳定性有较小的影响。

图5 温度对丙酮酸的稳定性F ig. 5 Effect of temperature on the stability of pyruvic acid

2.4.2 pH 的影响 配制50 g/L 的丙酮酸标准溶液，分别取10 mL 于试管中，以CaCO3为钙盐沉淀剂，配制5 mol/L 的NaOH 调节pH 至6.5。将过滤后的上清液稀释50 倍，然后用HPLC 检测溶液中的丙酮酸相对含量（峰面积表示），结果如图6 所示。 由图6 可知，向丙酮酸溶液中加入CaCO3对丙酮酸成分的影响较小，但是将pH 调至6.5 时，丙酮酸的峰面积显著下降，并且周围杂峰的峰面积开始显著增加，这说明在pH 6.5 时可能导致丙酮酸发生聚合或者其他反应。当在90 ℃处理20 min 时，丙酮酸的峰面积也下降了，但是没有pH 对丙酮酸的作用强。

3结 语

图6 pH 对丙酮酸的影响Fig. 6 Effect of pH on PA

丙酮酸是解脂亚洛酵母生产α-酮戊二酸的主要副产物，发酵过程中若在以Ca（OH）2维持较低的pH 值，发酵过程会积累大量的丙酮酸，而Ca2+有利于丙酮酸的积累；若以NaOH 调节pH，提取过程中酮戊二酸钙的回收效率低。并且在α-酮戊二酸提取过程中，在偏中性pH 和高温作用下，α-酮戊二酸的稳定性不受影响，丙酮酸却容易发生反应生成大量杂质， 且pH 对丙酮酸稳定性的影响大于温度对它的影响。 因此，当发酵液中含有较高浓度的副产物丙酮酸时，钙盐沉淀方法仅能提取纯化出α-酮戊二酸，无法同时获得高浓度的副产物丙酮酸，这将降低α-酮戊二酸的整个工业生产效益。 后期可以通过代谢改造使解脂亚洛酵母发酵高产α-酮戊二酸，而减少丙酮酸的积累， 然后利用钙盐沉淀法分离发酵液中的α 酮戊二酸，这样就能很大程度提高生产效益。