易错PCR 技术提高源于Sulfolobus acidocaldarius 麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性

姚锴琳， 宿玲恰， 吴 敬*

（1. 食品科学与技术国家重点实验室， 江南大学, 江苏 无锡214122；2. 江南大学 生物工程学院， 江苏 无锡214122；3. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室， 江苏 无锡214122；4. 江南大学 教育部食品安全国际合作联合实验室，江苏 无锡214122）

麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase，EC 5.4.99.15） 作用麦芽寡糖还原性末端的α-1,4 糖苷键使其变为α,α-1,1 糖苷键， 生成麦芽寡糖基海藻糖。 麦 芽 寡 糖 基 海 藻 糖 水 解 酶（MTHase，EC 3.2.1.141） 能水解麦芽寡糖基海藻糖中麦芽寡糖与海藻糖相连的α,α-1,1 糖苷键，生成海藻糖[1]和减少2 个葡萄糖基的麦芽寡糖， 是淀粉为底物制备海藻糖的关键酶。 目前，已经从多种微生物中克隆表达出海藻糖合成酶系[2]，包括中低温酶系和高温酶系，如节杆菌属（Arthrobacter）[3]、根瘤菌属（Rhizobium）[4]、嗜热硫矿硫化叶菌 （Sulfolobus solfataricusMT4）[5]、嗜酸热硫化叶菌 （Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909）[6-7]等。 海藻糖高温酶系通常具有较高的海藻糖转化率，并且具有良好的热稳定性，能在较高温度下转化淀粉生成海藻糖， 不容易在生产过程中污染杂菌。 但是，高温酶系相对于中低温酶系，具有蛋白表达量低的缺点。 因此，提高高温酶系的蛋白表达量，为工业化生成海藻糖[8-9]奠定基础显得愈发重要。

近年来, 非理性设计已经成了酶分子改造的重要手段之一，这主要是由于现阶段人们尚未完全掌握对酶的空间构象预测、结构分析等技术。 因此, 通过非理性设计特别是易错PCR 技术[10-11]结合高通量筛选技术进行酶特性改造的策略依然是人们关注的焦点。源于Sulfolohus acidocaldariusATCC 33909的MTSase 具有良好的热稳定性、耐酸的特点，但是表达量低成为该酶无法实现工业化生成的制约因素[12]。而目前，国内外尚未有通过非理性设计对高温来源的Sulfolohus acidocaldariusATCC 33909 的MTSase 进行分子改造的研究报道。本研究中拟通过易错PCR 技术结合高通量筛选技术对MTSase 进行定向进化，以期获得酶活提高的突变体酶，为其工业化应用奠定基础。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 菌株E. coliJM 109 和E. coliBL21 （DE3）： 为作者所在实验室前期保藏； 质粒pBackzero：购自大连宝生物公司；质粒pET-24（+）和来源Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909 的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因treY：为作者所在实验室前期保藏。

1.1.2 培养基 LB 液体培养基[13]，LB 固体培养基，SOB 培养基[12]，TB 培养基。

1.1.3 酶和试剂 限制性内切酶（NdeI、HindIII）、T4 DNA 连 接 酶、DNA 聚 合 酶Primer STAR HS、rTaq DNA 聚合酶、DL 5000 和DL 10000 DNA Marker 等：购自大连宝生物公司；细菌蛋白抽提试剂盒：购自康为世纪公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒：购自天根生化科技有限公司；蛋白凝胶电泳试剂盒、蛋白质Marker 标准品： 购自碧云天生物科技有限公司；麦芽六糖、麦芽糊精（DE 值9～13）：购自Sigma 公司；其他常规试剂：购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTSase 基因的易错PCR 以实验室早期保藏的源于Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909 的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因treY作为易错PCR的模板，并设计引物YC-PCR-F: 5’-TTTAACATAT GATTAGCGCGACCTATCG -3’, YC -PCR -R:5’ -TTTAAAAGCTTACATACGCACCAGGATAC-3’。PCR体 系（50 μL）：ddH2O（27.0 μL），Mg2+（25 mmol/L，10.0 μL），Mn2+（10 mmol/L，2.0 μL），10×rTaq buffer（5 μL），质粒DNA 模板（0.5 μL），引物YC-PCR-F(10 μmol/L，0.5 μL)，引物YC-PCR-R（10 μmol/L，0.5 μL），dNTP Mix （2.5 mM，4 μL），rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL，0.5 μL）。PCR 过程：94 ℃预变性4 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min 20 s，31 个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。

1.2.2 突变文库的构建 将PCR 所得的基因片段用1 g/dL 的琼脂糖凝胶电泳分离，使用胶回收试剂盒回收。将回收后的基因片段与克隆载体pBackzero相连接，转化E. coliJM109 感受态细胞，涂布于LB固体培养基（含100 μg/mL Amp），37 ℃培养8 h，用无菌水将固体平板上的所有阳性克隆洗脱，转至LB液体培养基（含100 μg/mL Amp），37 ℃培养4 h，用质粒抽提试剂盒提取混合质粒，用限制性内切酶NdeI和HindIII 进行双酶切， 与表达载体pET-24a 相连接。 将连接产物转化至E. coliBL21（DE3）感受态细胞， 涂 布 于LB 固 体 培 养 基 （ 含100 μg/mL kanamycin），37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆，构建突变文库。

1.2.3 突变文库的筛选 采用前期研究所得筛选方法： 以200 μL 0.2 g/dL 的麦芽糊精溶液作为底物，于60 ℃水浴锅中预热10 min，加入50 μL 稀释后的粗酶液，精确反应10 min，加入DNS 试剂终止反应。 于沸水中煮沸7 min，冷却，加入去离子水稀释，混匀，取200 μL 于酶标板中，在540 nm 处检测吸光值。 根据吸光值的大小，筛选出酶活提高的突变体酶。 将酶活提高的突变体送至无锡天霖生物科技公司进行基因测序。

1.2.4 MTSase 的表达及纯化 将能够表达野生型MTSase 和突变型酶的E. coli BL21 （DE3） 接种于10 mL LB 液体培养基 （含100 μg/mL kanamycin），37 ℃过夜培养，按体积分数5%的接种量转接至TB培养基（含100 μg/mL kanamycin），25 ℃，培养24 h。取一定体积的发酵液，12000 r/min、 离心5 min、弃上清液，用pH 8.0 的缓冲液重悬浮，后用超声破壁仪破壁，离心后收集上清液，即为发酵粗酶液。

将发酵粗酶液经过75 ℃热处理1 h，50 g/dL 硫酸铵沉淀，透析，经过阴离子交换柱MonoQ 进行蛋白质纯化[12]。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。纯化后的MTSase 及其突变体用于酶学性质及动力学参数的测定。

1.2.5 MTSase 的酶活测定

1）用20 mmol/L pH 6.0 的柠檬酸缓冲液，将麦芽六糖配成1 g/dL 的溶液， 取190 μL 的麦芽六糖溶液置于60 ℃水浴锅中预热， 加入10 μL 稀释后的酶液， 精确反应10 min， 加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液终止反应，取200 μL 反应液于具塞试管中，加入800 μL 水和1 mL DNS，沸水煮沸7 min，冷却，加入8 mL 去离子水，混匀。 于540 nm 测定吸光值。MTSase 的酶活定义为：每分钟消化1 μmol 的麦芽六糖所有酶量[14]。 酶活的计算公式为：

其中△A=A540（空白对照）-A540（样品）；990.86 为麦芽六糖的相对分子质量；1.0375 为DNS 测定麦芽六糖质量浓度标准曲线的斜率；N 为稀释倍数。

2）以麦芽糊精作为筛选底物时，MTSase 的酶活定义为：每分钟相当于转化1 μmol 葡萄糖变为非还原性糖所需要的酶量。 酶活的计算公式为：

其中△A=A540（空白对照）-A540（样品）；180 为葡萄糖的相对分子质量；0.2116 为DNS 测定葡萄糖含量标准曲线的斜率；N 为稀释倍数。

1.2.6 酶学性质探究

1）最适温度。 用20 mmol/L pH 6.0 的柠檬酸缓冲液，将麦芽六糖配成1 g/dL 的溶液，将190 μL 底物置于45～90 ℃（梯度为5 ℃）水浴锅中预热，加入10 μL 稀释后的酶液， 精确反应10 min， 加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液终止反应，取200 μL 反应液于具塞试管中，加入800 μL 水和1 mLDNS，沸水煮沸7 min，冷却，加入8 mL 去离子水，混匀。 于540 nm 测定吸光值。 定义最高酶活为100%。

2）温度稳定性。将酶液用pH 6.0 的缓冲液稀释后，置于70 ℃中保温，定期取样，按照方法1.2.5 所述的方法测定残余酶活，设定0 h 酶活为100%。

3）最适pH。 用20 mmol/L pH 4.0～8.0（梯度为0.5）的缓冲液溶解底物，配成1 g/dL 的麦芽六糖溶液，将190 μL 底物置于60 ℃水浴锅中预热， 加入10 μL 稀释后的酶液，精确反应10 min，加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液终止反应， 取200 μL 反应液于具塞试管中，加入800 μL 水和1 mLDNS，沸水煮沸7 min，冷却，加入8 mL 去离子水，混匀。 于540 nm测定吸光值。 定义最高酶活为100%

4）pH 稳定性。 将酶分别置于20 mmol/L pH 4.0～10.5（梯度为0.5）的缓冲液中，于4 ℃静置24 h，按照1.2.5 的方法测定酶活，定义0 h 酶活为100%。

5）Km值的测定。 用20 mmol/L pH 6.0 缓冲液溶解底物， 配成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5 g/dL的麦芽六糖， 将190 μL 底物置于60 ℃水浴锅中预热， 加入10 μL 稀释后的酶液，精确反应10 min， 加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液终止反应， 取200 μL 反应液于具塞试管中， 加入800 μL 水和1 mL DNS，沸水煮沸7 min，冷却，加入8 mL 去离子水，混匀。 于540 nm 测定吸光值。 使用GraphPad Prism 5 软件进行拟合分析， 计算得出Km值。

1.2.7 MTSase 的结构预测及突变位点分析 野生型的MTSase 的蛋白质结构通过数据库protein data bank 中获得（PDB ID 1IV8），突变体的结构则是通过SWISS-MODEL 进行同源建模获得的， 应用Pymol 进行酶分子拟合。

2结果与分析

2.1 易错PCR 条件的探究

在易错PCR 过程中， 需要加入Mg2+和Mn2+，Mg2+能与核酸骨架相互作用，起到稳定作用。 同时，Mg2+还能影响到DNA 聚合酶的活性。 Mg2+浓度过低，会降低PCR 的扩增效率，甚至导致扩增失败。但是，Mg2+浓度过高，则会产生非特异性扩增。 Mn2+能降低DNA 聚合酶对模板的特异性， 增加PCR 过程中碱基互补的出错率。 因此，在易错PCR 过程中需要调整2 种离子的浓度，以期获得不同突变频率的突变文库。 本研究中，以常规PCR 中5 mmol/L Mg2+浓度作为初始浓度， 通过调整体系中Mn2+的浓度，来探索易错PCR 条件。 PCR 结果如图1 所示。

图1 不同Mn2+浓度下的PCRFig. 1 Error-pone PCR with different Mn2+ion concentrations

从图1 中可知，Mg2+浓度为5 mmol/L 时， 结合不同浓度的Mn2+浓度， 均能使得目的基因有效扩增。 因此，Mg2+浓度选择为5 mmol/L。 在选定的Mg2+条件下，不同浓度的Mn2+浓度均能使得目的有效扩增，但是，考虑到Mn2+浓度过高会产生较高的出错率，使得后续表达的MTSase 失活；而Mn2+浓度过低会则出错率太低，甚至不发突变。 较为合适的出错率为MTSase 氨基酸序列中有2～5 个氨基酸突变。通过对不同浓度Mn2+PCR 产物测序，根据测序结果和2～5 个氨基酸突变为宜的突变原则，选择了Mn2+浓度0.4 mmol/L。

2.2 突变文库的构建及筛选

经过初步的易错PCR 条件探究后， 在确定的PCR 条件下扩增MTSase 的基因treY，经PCR 产物纯化后，连接到克隆载体pBackzero 上，转化E. coli JM 109 感受态细胞，涂布平板，将平板上所有菌落用无菌水洗脱至LB 液体培养基，过夜培养后，提取混合质粒pBackzero-treY， 将混合质粒pBackzerotreY 和表达载体pET-24a 分别经NdeI 和HindIII双酶切后，16 ℃过夜连接， 转入E. coli BL21（DE3）感受态细胞中。 本研究突变获得到转化子约5000株，所有转化子构成突变文库。

2.2.1 初筛 由于麦芽六糖价格昂贵，不适合用作筛选的底物。 因此，以价格低廉的麦芽糊精作为筛选的底物。 对构建好的突变文库，采用前期设计的筛选方法，进行初筛：将突变体与底物反应后的反应液同DNS 试剂进行显色反应， 置于酶标板中于540 nm 处测定吸光值，计算酶活。 初步筛选出酶活有较大幅度提高的突变株，（图中所示数值是以麦芽糊精为底物所计算的酶活（U/mL），红色框表示酶活有较大幅度提高的突变体， 黑色表示野生型MTSase，橙色框表示空白对照，即用缓冲液替代酶液）。 初筛结果见图2 所示。

图2 深孔板初筛结果Fig.2 Screening result of MTSase in the 96-well plate

2.2.2 复筛 将初筛获得的阳性转化子，5%接种体积分数接种于TB 液体培养基 （含100 μg/mL kanamycin），于25 ℃培养24 h，取一定发酵液，离心弃上清液，用pH 8.0 的缓冲液重新悬浮后，用超声破碎菌体，离心收集上清液，以麦芽六糖作为底物，测定酶活。 对突变文库筛选后，获得酶活提高较为显著的突变体D-6，其粗酶液酶活为41.2 U/mL，而野生型MTSase 酶活为26.65 U/mL。 突变体粗酶液酶活为野生型的1.54 倍。

2.3 突变体的基因测序

对酶活提高的突变体D-6 进行测序，发现D-6的基因在1295 和1757 位点发生突变， 其氨基酸序列均产生突变。 其序列分析结果如表1。

2.4 MTSase 及其突变体的分离纯化

离心收集发酵液中的菌体，使用高压匀浆机进行细胞破碎，8000 r/min，离心15 min，收集上清液，经过75 ℃热处理1 h，50 g/dL 的硫酸铵沉淀，透析，MonoQ 阴离子交换层析柱这3 步纯化后，获得电泳纯的野生型MTSase 和突变体D-6， 其SDS-PAGE分析结果如图3 所示。 对纯化后的野生型MTSase和突变体D-6 进行比活力测定， 分别为75.1 U/mg 和92.2 U/mg， 突变体酶的比活力为野生型MTSase 的1.22 倍。 同时，经计算可知突变体D-6 的粗酶液目的蛋白可溶性表达量为0.447 mg/mL， 而野生型MTSase 为0.356 mg/mL，表明突变体D-6 可溶性蛋白表达量提高。

表1 突变体测序结果Table 1 Sequencing results of the mutant

图3 纯化后的野生型MTSase 和突变体酶D-6 的SDSPAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE of purified WT-MTSase and mutant MTSase D-6

2.5 MTSase 及突变体的酶学性质分析

2.5.1 最适温度及温度稳定性分析 酶催化过程中，酶活力与温度密切相关。 当温度低于最适温度时，随着温度升高，酶促反应速率加快；当温度高于最适温度时，随着温度升高，酶促反应速率反而呈现下降趋势。 因此，需要探究突变体酶D-6 同野生型MTSase 在最适温度和温度稳定性上的差异。 突变体酶D-6 和野生型MTSase 的最适反应温度和温度稳定性结果如图4 和图5 所示。

从图4 可知， 野生型MTSase 的最适反应温度为70 ℃，而突变体酶D-6 的最适反应温度为60 ℃，较野生型MTSase 的最适温度略有下降。 从图5 可知，70 ℃下保温，D-6 的半衰期为5 d， 在相同条件下，而野生型MTSase 的相对酶活在5 d 时能保持在75.2%以上， 突变体酶D-6 的温度稳定性同野生型MTSasse 相比略有下降。 根据吴世雄等人报道[12]，双酶法制备海藻糖最适反应温度为60 ℃， 反应时间48 h，便能达到最大产率。 考虑到D-6 的热稳定性有所下降， 同时考察了突变体D-6 和野生型MTSase 在60 ℃保温48 h 后的残余酶活。结果如图6所示，保温48 h 后，突变体D-6 的残余酶活仍保持在80%以上。 因此即便温度稳定性略有下降，也不会影响该突变体应用于海藻糖的制备。

图4 野生型MTSase 和突变体酶D-6 的最适温度Fig. 4 Optimum temperature of WT-MTSase and D-6

图5 野生型MTSase 和突变体酶D-6 的70 ℃温度稳定性Fig.5 Thermal stability of WT-MTSase and D-6 at 70 ℃

图6 野生型MTSase 和突变体酶D-660 ℃温度稳定性Fig.6 Thermal stability of WT-MTSase and D-6 at 60 ℃

2.5.2 最适pH 及pH 稳定性分析 酶催化过程中，pH 即可以影响酶同底物的亲和力， 也能影响酶的稳定性。 因此，本研究需要探究突变体酶D-6 同野生型MTSase 在最适pH 和pH 稳定性上的差异。 在其他条件不变的情况下， 用方法1.2.6 测定突变体酶D-6 和野生型MTSase 的酶活。 结果如图7 和图8 所示。 突变体酶D-6 和野生型MTSase 的最适pH均为6.0。 野生型MTSase 在pH 4.0～10.5 相对酶活维持在89%以上， 而突变体酶D-6 在同等情况下，相对酶活维持在91.7%以上。 当大于pH 7.0 时，突变体酶D-6 的pH 稳定性优于野生型MTSase。

2.5.3 酶促反应动力学分析 用纯化后的野生型MTSase 和突变体酶D-6，以不同浓度的麦芽六糖作为底物测定其动力学参数Km。 其结果用GraphPad Prism 5 软件进行计算， 野生型MTSase 的Km值为（4.74±0.33）mmol/L，突变体酶D-6 的Km值为（2.77±0.22） mmol/L，表明突变体酶对底物的亲和性提高。

图7 野生型MTSase 和突变体酶D-6 的最适pHFig. 7 Optimum pH of WT-MTSase and D-6

图8 野生型MTSase 和突变体酶D-6 的pH 稳定性Fig. 8 Effect of pH on the stability of WT-MTSase and D-6

2.6 突变位点分析

在protein data bank 数据库中获取野生型MTSase 的蛋白质三维结构（PDB ID：1IV8）。 通过氨基酸序列比对， 突变体同野生型MTSase 的同源性为99%。 因此，突变体酶D-6 的蛋白质三维结构以野生型MTSase 蛋白质结构作为同源模板， 应用SWISS-MODEL 进行同源建模。

图9 MTSase 的活性中心与底物对接Fig. 9 Docking of the active center of MTSase with the substrate

G432 位点位于MTSase 的表面亲水区域，当G432 变成D432 后，侧链结构变大，亲水性变强，使得酶分子之间的疏水相互作用变弱， 不容易聚集，这可能在一定程度上减少包涵体的形成， 提高MTSase 的可溶性表达量。

突变位点G586D 位于Aβ8 与AEα14 的loop环上[15]，与氨基酸D596 和R600 位于同一loop 环上，而根据Wen-Chi Tseng 等[16]报道，D596 和R600 能与-2 及-3 位点的葡萄糖残基结合， 当G586 变成D586，loop 环的刚性变强[17]，从而使得D596 和R600与底物结合更加稳定。 推测是由于这个原因使得酶与底物的亲和性提高。

3结 语

高温酶系的MTSase 的酶活普遍偏低， 如源于Sulfolobus solfataricusATCC 35092[18]MTSase 在E.coliBL21 （DE3） 表 达 的 酶 活 仅 有0.222 U/mL，而Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909 的MTSase 在E. coliBL21（DE3）、Brevibacillus brevis、B. subtilis表达的酶活分别为26.65、16.3、17.5 U/mL[12]。 本研究对源于Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909 的MTSase进行定向进化，结合高通量筛选技术，获得了一株酶活提高的突变体酶D-6， 其酶活为41.2 U/mL。测定了突变体酶D-6 的酶学性质，突变体酶D-6在60 ℃保温48 h 后， 残余酶活仍保持在80%以上。 因此，虽然突变体酶温度稳定性较野生型略有下降，但是不影响其应用。 此外，希望以突变体酶D-6 最为出发菌，继续进行高通筛选，以期获得酶活提高更加显著的突变体，为工业化生产奠定基础。