植烷醇磷酸甘露糖的酶法合成及应用

李盛陶， 王 宁， 高晓冬*

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122；2.江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

蛋白质的糖基化修饰是真核细胞翻译后修饰的主要形式之一，在蛋白质折叠，转运和定位过程中发挥着重要作用[1]。 分泌蛋白和细胞表面蛋白的糖基化发生在内质网（ER）和高尔基体上，主要包括有：N-糖基化[2]、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定化[3]、O-[4]及C-甘露糖基化[5]等4 种修饰。 在ER 腔内的甘露糖基化修饰共同存在于上述4 种途径中，在糖基化修饰过程中起着重要的作用。 ER 腔内的甘露糖基化是利用糖基转移酶将甘露糖（Man）从供体多萜醇磷酸甘露糖（Dol-P-Man）转移到受体上，因此Dol-PMan 的合成对于理解不同种类的蛋白糖基化修饰具有重要的意义[6]。

在所有真核生物中，Dol-P-Man 的合成发生在ER 胞质区，利用多萜醇磷酸甘露糖合成酶（DPM 合成酶）将Man 从供体鸟苷二磷酸甘露糖（GDP-Man）转移到受体多萜醇磷酸（Dol-P）上[7]。 为了体外酶法合成Dol-P-Man，早期的研究利用酵母细胞及猪肝破碎后分离微粒体（含ER 成份），制备天然的DPM合成酶， 体外催化GDP-Man 和Dol-P 生成Dol-PMan[8-9]。 随着酵母DPM 合成酶基因（DPM1）的克隆鉴定[10]，后面的研究采用了重组大量表达酵母Dpm1用于Dol-P-Man 的合成[11]。但是由于多萜醇（Dolichol）的结构非常复杂， 含有超过100 个碳原子的脂肪链[12]，因此难以获得及在体外反应中难以溶解等因素进一步地限制了Dol-P-Man 的体外合成。 Wilson等发现植烷醇（Phytanol）作为一个简单的结构（含有20 个碳），能够替代Dolichol，在体外反应中酵母Dpm1 能够催化植烷醇磷酸（Phy-P）与GDP-Man 形成Phy-P-Man[13]。 但是结构简单的替代物Phy-PMan 作为供体能否被ER 腔内的甘露糖基转移酶（如N-糖基化途径中的酶Alg3）所识别并不知道。

为了解决上述存在的问题，本文作者成功地原核表达并纯化了酵母Dpm1，利用简单的结构Phy-P与GDP-Man 催化合成了Phy-P-Man。 更进一步地证明，Phy-P-Man 能够作为Alg3 的底物用于N-糖基化的研究。

1材料与方法

1.1 原核表达载体的构建

原核表达酵母Dpm1 蛋白质重组载体的构建如下：首先从NCBI 中下载酿酒酵母DPM1 基因序列，设计一对引物分别在5′ 端和3′ 端引入BamHI 和EcoRI 酶切位点。以酿酒酵母基因组为模板，扩增得到DPM1 PCR 产物， 酶切连接构建得到重组载体pET28a-Dpm1。 Dpm1 的突变蛋白质采用定点突变重叠PCR 方法引入[14]。 酵母Alg3 蛋白质的原核表达在N 端融合了Mistic 标签，Mistic 的序列参照以前的文献[15]。载体构建如下：首先人工合成Mistic 基因序列， 连接到pET28a 的NdeI 和NheI 酶切位点之间构建载体pET28a-Mistic。酿酒酵母ALG3 基因从酿酒酵母基因组上扩增， 连接到载体pET28a-Mistic 的BamHI 和XhoI 酶切位点之间构建载体pET28a-Mistic-Alg3。 所有载体都经过测序确认（华大基因）。

1.2 重组蛋白Dpm1 的大量表达与纯化

将重组原核表达质粒pET28a-Dpm1 转入Rosetta（DE3）（Thermo Scientific）原核表达宿主菌，构建重组原核表达宿主菌。挑取单菌落接种于5 mL LB（含Kan50 μg/mL 氯霉素34 μg/mL）液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜。取2 mL 过夜培养的菌液接种于200 mL TB（含Kan、氯霉素）液体培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡培养3 h，使OD600达到0.6～0.8，然后转移至16 ℃继续培养1 h 再加入IPTG 使其终浓度达到0.1 mmol/L, 200 r/min 诱导培养20 h。 离心收集菌体， 重悬于20 mL A 缓冲液 （25 mmol/L Tris/HCl（pH 8.0）,150 mmol/L NaCl）中，超声破碎，4000 g、4 ℃离心20 min，弃沉淀，收集上清液20000 g，4 ℃高速离心90 min， 弃上清液， 沉淀重悬于10 mL B缓冲液 （25 mmol/L Tris/HCl （pH 8.0）, 150 mmol/L NaCl， 体积分数1% Triton X-100）4 ℃放置30 min后12000 g 离心30 min，收集上清用于纯化。 纯化步骤如下：HisTrap HP 1 mL 亲和层析柱（GE）先用10 倍体积的B 液流速1 min/mL 平衡后，上样10 mL左右上清液，然后分别用含20、60、500 mmol/L 咪唑的B 液各10 mL 洗柱子， 分别收集与离心管中，取样进行SDS-PAGE 电泳检测。

1.3 重组蛋白Mistic-Alg3 的大量表达、膜成份制备及western blotting 检测

将重组原核表达质粒pET28a-Mistic-Alg3 转入Rosetta（DE3）原核表达宿主菌。 表达条件与上述Dpm1 一致。 为了制备含有Mistic-Alg3（M-Alg3）蛋白的大肠杆菌膜成份，离心收集诱导表达的10 mL 重组菌体，重悬于1 mL A 缓冲液中，超声破碎，4000 g、4 ℃离心20 min，弃沉淀，收集上清液100000 g、4 ℃高速离心60 min， 弃上清液， 沉淀重悬溶解于0.1 mL 缓冲液 （50 mmol/L 2-（N-吗啉） 乙磺酸（MES） pH 6.5，体积分数30% glycerol），即得到大肠杆菌细胞膜成分， 蛋白免疫印迹（Western blotting）进行检测M-Alg3 的表达。 具体操作如下：取10 μg 细胞膜成份进行SDS-PAGE， 然后转到PVDF 膜上。 5 g/dL 的脱脂牛奶（上海生工）封闭1 h后，2000 倍 稀 释 的 一 抗 （anti-His Mouse mAb,TRANS）孵育1 h，TBST 洗涤3 次。 5000 倍稀释的二抗（HRP-Goat Anti-Mous lgG, TRANS）孵育1 h，TBST 洗涤3 次后，ECL 显色试剂（BIO-RAD）显色，放入ImageQuant LAS 4000 凝胶成像系统（GE）中曝光观察结果。

1.4 重组蛋白Dpm1 的酶活检测

Dpm1 的底物phytanyl-phosphate（Phy-P）根据早期的文献和作者之前的文章化学合成[16-17]。 标准的酶反应条件如下 （50 μL 体系）：50 mmol/L Tris/HCl （pH 7.5），10 mmol/L MgCl2， 体积分数1%NP-40，20 mmol/L Phy-P，50 mmol/L GDP-Man （Sigma） 和2 mg/mL 纯化的Dpm1 蛋白。 反应在30 ℃下孵育10 h。 酶的活性检测用薄层层析方法（TLC）检测，具体如下：反应结束后，用毛细管取少量点于硅胶板（Merck）， 吹干后在氯仿/甲醇/水（6.5∶3.5∶0.4, 体积比）的展开剂中层析。 结束后，浸于乙醇/硫酸（19∶1,体积比）溶液中，然后加热显色。

1.5 重组蛋白M-Alg3 的酶活检测

重组蛋白M-Alg3 的底物Phy-PP-GlcNAc2-Man5（Phy-PP-M5） 在我们之前的文章中合成[17-18]。标准的酶反应条件如下 （60 μL 体系）： 14 mmol/L MES（pH 6.0），4 mmol/L potassium citrate，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MnCl2，1 mmol/L sucrose，50 μmol/L Phy-PP-M5，2 mmol/L Phy-P-Man， 体积分数0.05%NP-40 和20 mg/mL 的M-Alg3 膜成份。反应在30 ℃下孵育12 h。 反应结束后加入0.2 mL 浓度为20 mmol/L 的HCl 于100 ℃下酸解1 h，释放糖链与脂肪链Phytanol。 酸解产物12000 g 离心1 min，上清液通过1 mL 固相萃取填料Supelclean ENVICarb Slurry（Sigma）进行纯化，糖链成分用3 mL 体积分数25%的乙腈洗脱后冷冻干燥。 最终得到的纯化糖链溶解于40 μL 的纯水中，通过超效液相色谱仪Dionex Ultimate 3000 UPLC（Thermo Scientific）自动进样1 μL 到氨基色谱柱 （Waters Acquity UPLC BEH Amide Column 1.7 μm 2.1 mm×100 mm）中，乙腈线性梯度洗脱（溶液A： 乙腈；B： 水； 洗脱条件（体积分数）： 0～2 min, 20% B；2～15 min, 20%～50%B；15%～18 min；50% B；流速： 0.2 mL/min）分离底物与产物。 流出液通过ESI-MS 仪器TSQ Quantum Ultra（hermo Scientific）步检测相对分子质量（离子模式下扫描400～1600 m/z 范围）

2结果与分析

2.1 重组蛋白Dpm1 的纯化及活性检测

基于多萜醇磷酸甘露糖（Dol-P-Man）在ER 糖基化4 种修饰中的重要作用， 本研究将利用酵母Dpm1 进行酶法合成， 并采用结构简单的Phytanol（含有20 个碳），替代Dolichol（含有100 个碳以上）（图1）。

图1 Dpm1 催化生产Phy-P-Man 的反应示意图Fig. 1 Yeast Dpm1 catalyzes the transfer of mannose from GDP-Man to Phy-P to produce Phy-PMan

首先构建了原核表达质粒pET28a-Dpm1，转入Rosetta DE3）大肠杆菌中，低温过夜诱导。 诱导菌体破碎提取细胞膜成份，溶解于去污剂Triton X-100，利用镍亲和层析纯化。 对500 mmol/L 咪唑洗脱液SDS-PAGE 分析，结果如图2（a）显示3×104左右，有一条明显的条带，与Dpm1 预期的大小相一致，成功实现了Dpm1 的纯化。 接下来，利用纯化的Dpm1催化Phy-P 与GDP-Man 形成Phy-P-Man。 如图2(b)的TLC 结果所示，底物Phy-P 的比移值（Rf）为0.64（条带1），在加入Dpm1 后Rf 变为0.58（条带2）。Rf的降低是由于亲水性的Man 基团加入到底物中形成了产物Phy-P-Man 导致极性变大，从而在展开剂中迁移率变慢。 此结果说明原核表达纯化的Dpm1 活性很高， 能完全催化Phy-P 生成Phy-PMan。

图2 酿酒酵母Dpm1 的纯化及活性检测Fig. 2 Purification and activity detection of yeast Dpm1

2.2 Dpm1 的保守性模体 （motif） DXD 为活性所必须

前期的文章证明了Dpm1 的酶活依赖于Mg2+的加入[19-20]。 目前，大量的研究表明采用GT-A 方式折叠的糖基转移酶含有DXD motif，2 个天冬氨酸能够与Mg2+结合发挥催化功能[21]。 我们通过carbohydrate active enZyme（CAZy）数据库检索，Dpm1 属于GT2类，采用GT-A 方式折叠（http：//www. cazy.org）。 我们因此推测Dpm1 依赖于Mg2+的原因可能存在DXD motif。 接下来，对不同物种来源的Dpm1 进行序列比对，发现存在一个保守性的DXD motif（图3（a）），在酵母Dpm1 的95-97 位氨基酸序列上。为了验证酵母Dpm1 的DXD motif 的重要作用， 我们构建了D95A 和D97A2 个突变，在大肠杆菌中进行了纯化（图3（b）），并测定了它们的活性。 TLC 结果如图3（c）所示，D95A（条带1）和D97A（条带2）相对于野生型（WT）完全丧失了活性，说明了DXD motif对Dpm1 活性的重要作用。更进一步地，与以前的报告一致， 当在野生型Dpm1 的反应中不加Mg2+同样地丧失了活性（条带3）。 因此，推测DXD motif 在Dpm1 的作用可能和别的GT-A 类糖基转移酶一样能够与Mg2+结合参与催化功能。

图3 Dpm1 的DXD motif 突变蛋白的纯化及活性检测Fig.3 Purification and activity detection of Dpm1 mutants in DXD motif

2.3 Dpm1 的产物Phy-P-Man 能够被糖基转移酶Alg3 催化

通过纯化的Dpm1 合成了Phy-P-Man，但能否替代Dol-P-Man 应用于ER 腔内的甘露糖基化修饰并不清楚。 为了弄清上述问题，选择了N-糖基化途径中以Dol-P-Man 为底物供体的酶Alg3 作为研究对象。 糖基转移酶Alg3 能够催化Dol-PPGlcNAc2 -Man5 和Dol -P -Man 生 成Dol -PP -GlcNAc2-Man6[22]。 为了验证Alg3 能否以Phy-PMan 为底物供体，利用实验室前期合成的Alg3 的替代底物Phy-PP-GlcNAc2-Man5（Phy-PP-M5），并表达Alg3 蛋白进行体外反应（图4）。

图4 Alg3 催化Phy-PP-M5 与Phy-P-Man 生成Phy-PP-M6 的反应示意图Fig. 4 Alg3 catalyzes the transfer of mannose from Phy-P-Man to Phy-PP-M5 to produce Phy-PP-M6

首先，尝试原核表达酿酒酵母Alg3，由于Alg3为多跨膜域蛋白质，在大肠杆菌中容易降解，因此在N 端融合了促进真核膜蛋白表达的Mistic 标签（M-Alg3）[15]。 图5 的Western blotting 结果显示相对于空载对照（条带1）在6.5×104左右处，有一条明显的条带（条带2），与M-Alg3 预期的大小相一致，从而证明M-Alg3 成功的在大肠杆菌中进行了表达。

图5 酵母重组蛋白M-Alg3 的原核表达Western blotting 图Fig.5 Western blot analysis of expression of yeast M-Alg3

接下来， 利用含有重组蛋白M-Alg3 的大肠杆菌膜成份催化Phy-PP-M5 与Phy-P-Man， 反应结束后酸解去掉脂肪链部分， 纯化糖链后LC-MS 分析结果。 如图6（a）所示，与空载大肠杆菌膜成份比较， 含有重组蛋白M-Alg3 的大肠杆菌膜成份催化后多了一组峰。 ESI-MS 确证了2 组峰分别起源于底物Phy-PP-M5 （14.6，14.8） 和产物Phy-PP-M6（15.4，15.5）（图6（b））。 综上证明Phy-P-Man 能够被Alg3 所催化应用到N-糖基化途径研究。

图6 Phy-P-Man 用于重组蛋白M-Alg3 的催化反应Fig. 6 Activity detection of recombinant M-Alg3 using Phy-P-Man as a donor

3结 语

Dpm1 为所有真核生物的必须基因，人体Dpm1发生突变会导致严重的先天性糖基化缺陷综合症（CDG）[23]。 本研究获得了纯化的酵母Dpm1 蛋白，并鉴定了重要的DXD motif， 有可能跟Mg2+结合参与催化。 未来的研究将利用纯化的蛋白质，获得Dpm1蛋白的晶体结构，解释其催化机制，更重要的是，结构信息的获得对于理解CDG 发病的分子机制具有重要的意义。 另外， 本研究中通过Dpm1 将Phy-P与GDP-Man 催化合成了Phy-P-Man。 Phy-P-Man相对于天然结构Dol-P-Man 具有结构简单，水溶性好等优点， 并且Phy-P-Man 能够被Alg3 所催化应用到N-糖基化途径研究。 另外，N-糖基化途径中Alg3 反应后，Alg9 和Alg12 催化的后三步的反应形成高甘露糖结构（Dol-PP-M9） 也是以Dol-P-Man为底物供体[2]。 接下来的研究将进一步地以Phy-PMan 为底物供体期望能够体外合成Phy-PP-M9 结构。 同样的，Phy-P-Man 将来也可应用于GPI 锚定化、O-及C-甘露糖基化的研究。 特别是在人体中ER 腔内的甘露糖基化修饰途径中的酶发生突变将会导致严重的先天性糖基化缺陷综合症 （CDG）[24]，我们合成的Phy-P-Man 作为这些酶的底物，将会应用于对CDG 相关突变酶的活性检测乃至开发出衡量疾病严重程度的定量方法。