米曲霉形态对L-苹果酸生产的影响

周 洁， 罗秋玲， 丁 强， 陈修来， 刘立明*

（1. 食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；3. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡214122）

L-苹果酸是一种重要的从可再生能源碳水化合物转化的化学品， 已被美国能源部列为12 大构架化合物之一。 作为生物体TCA 循环的中间体，L-苹果酸广泛应用于食品、烟草、化工和医药行业[1]。其具体用途如下：1） 在食品行业：L-苹果酸可以作为一种酸性和味觉增强剂代替柠檬酸，还可以作为食品保色保鲜剂和食品抗氧化剂等；2） 在烟草行业：苹果酸衍生物（如酯类）能作为烟草调味剂；3）在化工行业：是良好的络合剂、酯剂，用于牙膏配方、合成香料配方等，还可以作为除臭剂和工业洗涤剂的成分；4） 在医药行业，可作为抗癌药物前体、血管吻合剂，同时还可以配合各种片剂使其具有水果味，并有助于在体内扩散、吸收。

目前，利用发酵法生产L-苹果酸时主要使用米曲 霉 （Aspergillus oryzae）、 黄 曲 霉 （Aspergillusflavus）[2-4]。 虽然黄曲霉能高产L-苹果酸，但其产生的黄曲霉毒素具有强致癌性， 不能作为食品添加剂。 而米曲霉作为食品安全菌株，广泛用于发酵工业。 米曲霉作为丝状真菌，在液态深层发酵过程中生长缓慢、机械剪切力耐受性较差，易形成丝状、团状和球状等形态，形态的变化通常会引起发酵液流变性的改变，使其发酵过程变得十分复杂并且难以控制。 丝状真菌在发酵过程中的形态受多个基因调控，其中包括hypA/podA、swoF和sepA等基因[5]。这些基因编码的蛋白质控制细胞大小、菌丝极性或细胞间隔膜的间距来改变菌体形态。 菌体形态还受到营养条件（如碳氮源种类及其浓度、金属离子的添加等）、环境条件（如温度、pH 值、孢子浓度、搅拌转速、通气量、表面活性剂等外源添加物）等因素的影响[6-9]。

曲霉在液体深层发酵过程中，菌体宏观和微观形态的变化对代谢产物的合成有重要的影响，不同菌株积累代谢产物最佳形态各不相同。 Aftab Ahamed[10]等人在利用Aspergillus niger生产蛋白酶时发现，当菌体为球状时蛋白酶产量低于150 U/g，而当菌体为絮状时蛋白酶产量可超过350 U/g。 而Aspergillus niger生产柠檬酸则以球状为佳，与菌球相比非菌球生产柠檬酸不仅产量低， 葡萄糖吸收率、氧气吸收速率和二氧化碳释放速率都处于低水平[11]。 此外，Aspergillus terreus生产衣康酸和洛伐他汀、Rhizopus oryzae生 产 富 马 酸、Rhizopus arrhizus生产乳酸等最佳形态都为菌球[12-15]。 作者通过研究营养条件和环境条件对米曲霉菌体形态的影响，确定最佳形态并分析得到菌体形态与L-苹果酸产量的关系，从而由此调控A. oryzae形态在发酵罐上获得高产L-苹果酸。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种A. oryzaeFMME 338 （CCTCC NO：M 2016401） 保藏于中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 试剂 L-苹果酸标准样品：Sigma 公司产品；葡萄糖：山东西王生化科技有限公司产品；其他化学试剂均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司产品。

1.1.3 培养基 斜面培养基 （g/L）： 去皮马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15；自然pH。

种子培养基 （g/L）： 葡萄糖60， 胰蛋白胨3，KH2PO40.75，K2HPO4·3H2O 0.98，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.075，1 mL 微量元素溶液 （NaCl 5, FeSO4·7H2O 5，去离子水1 L）。

发酵培养基 （g/L）： 葡萄糖120，CaCO3（60～100）， 胰蛋白胨6，KH2PO40.2，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.075，1 mL 微量元素溶液（同上） 。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 生孢培养： 从-80 ℃的甘油保藏管中取一环孢子悬液接种于斜面培养基，30 ℃恒温培养箱中培养4～6 d；

种子培养： 将培养的成熟孢子用质量分数0.05%吐温80 洗下，经玻璃珠打散后过滤制成孢子悬浮液，用血球计数板计数。 将孢子悬浮液转接至种子培养基中，种子培养基的装液量为250 mL 的三角瓶中装入50 mL 培养基， 培养转速200 r/min，在30 ℃下恒温摇床培养24 h；

发酵培养（摇瓶）：按体积分数10 %的接种体积分数，将液体种子接种到发酵培养基中，发酵培养基的装液量为250 mL 三角瓶中装入50 mL 培养基，转速200 r/min，30 ℃下恒温摇床培养6 d；发酵培养（发酵罐）：按体积分数10%接种，将液体种子接种到发酵培养基中，发酵培养基的装液量为30 L发酵罐装入16 L 培养基，转速200～600 r/min，通气量1～3 vvm，30 ℃下培养6 d。

1.2.2 分析方法 L-苹果酸和葡萄糖质量浓度测定：用高效液相色谱（HPLC） 分析检测，色谱柱为AminexHPX-87H Ion （300 mm×250 mm），流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min；柱温为35 ℃；波长为215 nm； 进样量为10 μL；L-苹果酸质量浓度检测器为紫外检测器， 葡萄糖浓度检测器为示差检测器；生物量测定：采用干质量法，用2 N 的HCl 除去发酵液中的CaCO3， 将发酵液经滤纸过滤后用蒸馏水洗涤3 遍再抽滤， 置于干燥箱中60 ℃烘干至恒重，用称重法测定其生物量；菌体形态测定：Canon IXUS115 数码相机拍摄，菌球直径使用千分尺测量。

2结果与讨论

2.1 氮源对米曲霉菌体形态和产酸的影响

采用单因素实验在摇瓶中研究有机氮源和无机氮源对A. oryzae 发酵过程中形态和产酸的影响（表1）。结果发现，当以胰蛋白胨和大豆蛋白胨为氮源时，产酸和菌体生长均好于其余氮源。 研究发现，氮源种类对A. oryzae 菌体形态有显著的影响，除尿素以外，其他所有氮源都能使A. oryzae 在培养基中形成数量、大小都不同的菌球。 氮源对A.oryzae 形态和L-苹果酸生产的影响如表1 所示。当黄豆粉为氮源时，菌球浓度、菌球直径、单位体积发酵液菌球总体积（V 值）比胰蛋白胨时分别提高4.90%，4.22%和18.9%；比大豆蛋白胨时分别提高114.0%、28.0%和347.1%。当氮源为黄豆粉和胰蛋白胨时，菌体质量浓度（以干质量计算）在15～16 g/L 左右。 当大豆蛋白胨作为氮源时菌体质量浓度达到最高 （23.7 ± 0.74） g/L。当氮源为胰蛋白胨时，L-苹果酸产量和得率比大豆蛋白胨时分别提高22.3%和36.6%； 比黄豆粉为氮源时分别提高58.8%和19.1%. 但是，以大豆蛋白胨为氮源时，葡萄糖消耗比胰蛋白胨和黄豆粉时分别高出10.7%和49.2%。 因此，胰蛋白胨是最佳有机氮源。 此外，无机氮源的添加不利于A. oryzae 的生长和L-苹果酸的积累。 当氮源为尿素时，A. oryzae 在发酵液中以大量菌丝和少量菌球状呈现（图1）。 以（NH4）2SO4和NH4Cl 为 氮 源 时， 菌 球 浓 度 分 别 为（110±6） 个/mL 和（86±4）个/mL，菌球直径分别为（0.625±0.01） mm 和 （0.652 ± 0.01） mm，V 值均不超过15.0 mm3/mL。 以（NH4）2SO4为氮源时，菌体质量浓度比尿素和NH4Cl 时分别提高125.0%和4.85%。 以NH4Cl 为氮源时L-苹果酸产量比尿素和（NH4）2SO4时分别提高13.8%和5.60%。尿素为氮源时葡萄糖消耗比（NH4）2SO4和NH4Cl 为氮源时分别高出36.7%和27.1%。 然而，当NH4Cl 和（NH4）2SO4为氮源时得率比尿素时均提高47.4%。 所以，NH4Cl为最佳无机氮源。 结果表明，以胰蛋白胨为氮源时，菌球浓度、菌球直径、V 值、菌体质量浓度、L-苹果酸产量、葡萄糖消耗和产率比NH4Cl 为氮源时分别提高137.2%、81.7%、1329.0%、158.9%、303.0%、101.5%和100.0%。 表明有机氮源促进菌体生长、L-苹果酸积累和葡萄糖消耗并提高产率。 因此，胰蛋白胨是最佳氮源。

2.2 CaCO3 质量浓度对米曲霉菌体形态和产酸的影响

表1 氮源对米曲霉形态和L-苹果酸生产的影响Table 1 Effect of nitrogen source on the morphology of Aspergillus oryzae and the production of L-malate

在培养基中添加CaCO3不仅能控制发酵过程的pH，中和苹果酸形成钙盐沉淀，以固体颗粒存在的CaCO3对菌球形态也有明显的影响。 研究表明，随着CaCO3质量浓度从60 g/L 增加到100 g/L，A. oryzae 菌球浓度从208 个/mL 增加到250 个/mL，同时， 菌球直径从1.173 mm 降低到0.810 mm，V值由（175.4±8.77）mm3/mL 降低到（69.4±1.70） mm3/mL。培养基中CaCO3质量浓度越高，固形物越多，对菌体的磨损程度就越高，菌球直径逐渐减小。 此外，孢子在萌发过程中包裹一定量的CaCO3更有利于形成菌球。 CaCO3质量浓度对产酸和菌体浓度影响见图2（a） （b）。 当CaCO3质量浓度为80 g/L 时，菌体浓度比当CaCO3质量浓度为60 g/L 和100 g/L 时分别高出13.7%和5.75%。 向培养基中添加80 g/L 的CaCO3时，最高在发酵144 h 后积累（59.7±1.71） g/L的L-苹果酸， 比CaCO3质量浓度为60 g/L 和100 g/L时分别高出9.69%和5.87%。 在CaCO3质量浓度为80 g/L 时， 葡萄糖消耗比60 g/L 和100 g/L 时分别高出8.53%和1.38%。但是，CaCO3质量浓度为80 g/L时产率最高， 比60 g/L 和100 g/L 时分别提高1.79%和3.64%。 表明CaCO3最优质量浓度为80 g/L。

图1 氮源对米曲霉形态的影响Fig. 1 Effect of nitrogen source on morphology of Aspergillus oryzae

图2 CaCO3 质量浓度对L-苹果酸产量、菌体质量浓度、菌球浓度、菌球直径和葡萄糖消耗的影响Fig. 2 Effect of concentration of CaCO3 on L-malate production，dry cell weight，pellet number，pellet size diameter and consumption of glucose

2.3 搅拌转速对米曲霉菌体形态和产酸的影响

以摇瓶发酵优化结果为基础，本工作研究了30 L 发酵罐中搅拌转速对A. oryzae菌体形态和L-苹果酸积累的影响。 当搅拌转速为200 r/min 时，菌体在发酵罐中呈菌丝状，当搅拌转速在400～600 r/min范围内，A. oryzae主要形成菌球， 随着搅拌转速的提高，单位体积发酵液中菌球浓度不断增加，菌球直径不断减小（表2）。 搅拌转速从400 r/min 提高到600 r/min 时，菌球浓度增加而菌球直径减小。 搅拌转速为600 r/min 时V值为（99.3±5.06） mm3/mL，比搅拌转速是400 r/min 时降低了35.0%。不同转速搅拌带来的流体流动与剪切力会显著影响菌体的形态，搅拌转速越大，液体流动速度越快，剪切力越大，更利于形成数量多的小直径菌球。 Park J P 等[16]考察了搅拌强度对蛹虫草 （Cordyceps militaris） 菌体形态的影响， 研究表明搅拌转速为300 r/min 时，菌球直径小并且表面光滑， 但当搅拌转速为50 r/min时，菌球大而松散。 菌体质量浓度也随着搅拌转速的提高而增加， 当搅拌转速从200 r/min 增加到400 r/min时，菌体质量浓度提高了14.4%。原因可能是随着搅拌转速增加发酵液溶氧也不断增加，从而利于菌体生长导致菌体质量浓度增加。 然而，当搅拌转速继续增加到600 r/min 时， 菌体质量浓度并没有大幅度增加（约19.8 g/L）。 结果如图3 所示，随着搅拌转速的提高，L-苹果酸的产量也随之增加， 当搅拌转速是600 r/min 时， 最高积累83.0 g/L 的L-苹果酸， 比搅拌转速是200 r/min 和400 r/min 时分别提高了63.4% 和31.5%； 葡萄糖消耗比搅拌转速是200 r/min 和400 r/min 时分别提高了24.1%和17.0%，产率比搅拌转速是200 r/min 和400 r/min 时分别提高了31.4%和12.2%。 结果表明高搅拌转速促进A. oryzae生长， 增加葡萄糖消耗和L-苹果酸积累，最佳搅拌转速是600 r/min。 在丝状真菌发酵过程中， 在菌体形态和搅拌转速之间有一种最优的状态，在这种情况下，搅拌可能也会对细胞的氧气供应进行调节[17]。

图3 搅拌转速对L-苹果酸产量， 菌体质量浓度和葡萄糖消耗的影响Fig. 3 Effect of agitation speed on L-malate production,dry cell weight and consumption of glucose

表2 搅拌转速对菌体形态的影响Table 2 Effect of agitation speed on the morphology of Aspergillus oryzae

2.4 通气对米曲霉菌体形态和产酸的影响

通气条件同样是影响发酵罐中溶氧水平的一个重要因素，因此进一步研究了通气条件对A. oryzae菌体形态和产酸的影响。 如图4 所示，随着通气量增加，单位体积发酵液菌球数量不断增加，通气量为3 vvm 时单位体积发酵液菌球浓度为（273±6） 个/mL，比通气量为1 vvm 和2 vvm 时分别高出46.0%和8.76%。 通气从1 vvm 提高到2 vvm 时菌球直径从0.997 mm 降低为0.834 mm。 当通气量为3 vvm 时，菌球直径没有进一步缩小（约0.832 mm）。 此外，通气量为2 vvm 时，V 值比1 vvm 和3 vvm 时分别降低23.1%和10.2%。 菌体质量浓度随着通气量的提高也不断增加，结果见图4（b）， 通气量为3 vvm 最大菌体质量浓度为33.6 g/L，比通气量为1 vvm 和2 vvm 分别高出69.8%和14.7%。 通气量为2 vvm时，L-苹果酸产量比1 vvm 和3 vvm 时分别提高32.5%和21.9%。 但是，葡萄糖消耗并没有随着通气量的改变而发生明显变化（～180 g/L），这表明增加通气并不能促进葡萄糖消耗。 当通气量为2 vvm时， 产率比1 vvm 和3 vvm 时分别提高34.8%和26.5%。因此，最适通气量为2 vvm。结果表明氧气的传递是影响L-苹果酸在发酵罐中积累的一个重要因素，同样的现象也存在于葡萄糖酸发酵过程中[9]。

图4 通气量对L-苹果酸产量、菌体质量浓度、菌球浓度、菌球直径和葡萄糖消耗的影响Fig. 4 Effect of aeration rate on L-malate production，dry cell weight，pellet number，pellet size diameter and consumption of glucose

2.5 米曲霉形态对L-苹果酸产量的影响

菌球形态与细胞代谢关系紧密，单位体积发酵液菌球总体积 （V 值） 与L-苹果酸产量的关系如（图5） 所示。 摇瓶上V 值与L-苹果酸产量的关系是：y=-0.0046x2+1.1307x-0.6498，R2= 0.9897；发酵罐上V 值与L-苹果酸产量的关系是：y=0.0091x2-2.6346x+253.53，R2=0.9684。 结果表明， 在摇瓶水平，L-苹果酸产量随着V 值增加先上升后降低；当V 值在122.9 mm3/mL 左右时，L-苹果酸产量达到最高（约68.8 g/L）。 原因可能是当V 值低时，菌球个数和菌球直径的值处于低水平，菌球内部结构疏松密度小不利于菌球生长和产酸， 而当V 值高时，菌球浓度和菌球直径的值处于高水平，单位发酵液菌球数量增加导致发酵液粘稠，菌球直径过小导致内部结构致密从而不利于O2和营养物质的传递[18]。在乳酸发酵过程中也出现了相似的情况，当菌球密度较低时内部中空不利于产酸， 而当菌球密度大于60 kg/m3时影响传质抑制产酸[19]。 在发酵罐水平，L-苹果酸产量随V 值增加而逐渐降低， 当V 值为76.4 mm3/mL 时，L-苹果酸产量最高为109.9 g/L。

图5 摇瓶上V 与L-苹果酸产量的关系和发酵罐上V 与L-苹果酸产量的关系Fig. 5 Relationship between the total of pellet in the unit volume fermentation （V） and L-malate production

3结 语

本文通过研究氮源种类、CaCO3质量浓度、搅拌转速和通气量对A. oryzae 菌体形态和L-苹果酸产量的影响，得出最佳营养和环境条件为：胰蛋白胨为氮源，CaCO3质量浓度为80 g/L， 搅拌转速600 r/min，通气量2 vvm。以菌球浓度、菌球直径和单位体积发酵液菌球总体积（V 值） 来表征形态，并研究得出V 值与L-苹果酸产量的关系。 在30 L 发酵罐中：发酵132 h，菌球浓度251 个/mL，菌球直径0.834 mm，V 值为76.4 mm3/mL，A. oryzae 消耗177.6 g/L 葡萄糖，L-苹果酸质量浓度达到109.9 g/L，产率为0.62 g/g，生产强度达到0.83 g/（L·h）。