正相高效液相色谱法测定L-苹果酸中的对映异构体D-苹果酸

段先哲　李　南*　谭凯旋　谢焱石　陈　亮　胡　杨　冯志刚　韩世礼　马　强

(1. 南华大学，衡阳 421001; 2. 湖南省核燃料循环技术与装备协同创新中心，衡阳 421001)



正相高效液相色谱法测定L-苹果酸中的对映异构体D-苹果酸

段先哲1,2李南1,2*谭凯旋1谢焱石1陈亮1胡杨1冯志刚1韩世礼1马强1

(1. 南华大学，衡阳 421001; 2. 湖南省核燃料循环技术与装备协同创新中心，衡阳 421001)

建立了测定L-苹果酸中对映异构体D-苹果酸的的正相高效液相色谱检测方法。色谱柱为手性色谱柱CHIRALPAK-IC(4.6×250mm；5μm)，流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1，流速为0.5mL/min，进样量为100μL，检测波长为210nm，柱温为35℃。系统适用性实验中L-苹果酸和D-苹果酸的理论塔板数大于5000，L-苹果酸与相邻峰的分离度为2.6，D-苹果酸与相邻峰的分离度为2.9。此方法检测L-苹果酸中的D-苹果酸敏度高，分离度良好。溶液稳定性实验中，在24小时内测定D-苹果酸含量的相对标准偏差为5.78%，溶液在24小时内稳定性良好。精密度实验中6次重复进样D-苹果酸含量的相对标准偏差为3.59%，精密度良好。L-苹果酸的检出限为0.22ng。该方法可用于分离L-苹果酸及其对映异构体D-苹果酸。

L-苹果酸对映异构体D-苹果酸正相高效液相色谱法

苹果酸，又名2-羟基丁二酸，有两种对映异构体，即D-苹果酸和L-苹果酸。大自然中，苹果酸以3种形式存在，即D-苹果酸、L-苹果酸及其混合物DL-苹果酸。L-苹果酸会在人体中自然产生并具有生物活性，是人体一种必须的有机酸，作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品行业中；D-苹果酸的生理活性低，生物体内积累过量的 D-苹果酸时会产生病变[1]；美国粮食和药物管理局(FDA)规定DL-苹果酸不能用于婴儿食品添加剂[2]。在医药行业，苹果酸常作为一种药物成分添加在一些药物制剂中，能明显提高药物主要成分的吸收率；苹果酸还可以治疗肝病、贫血、免疫力低下等多种疾病；在药物研究中苹果酸作为一种药物成分，就必须严格控制其本身带来的其它杂质，必须严格控制D-苹果酸的限度，所以对L-苹果酸及其中的D-苹果酸的测定方法的研究具有重大意义。目前国内对苹果酸含量测定的方法有酶法[2]、生物传感器法[3]、双波长分光光度法[4]、离子色谱法[5-8]、气相色谱法[9，10]、毛细管电泳法[11，12]和高效液相色谱法[13-22]等方法。酶法虽操作简易，但由于催化反应的酶本身特异性不高，易于催化其它底物，使测定结果产生较大误差。生物传感器法，需要制作两种电极，并且需要分别测定D-苹果酸和L-苹果酸，操作比较繁琐。其它方法对苹果酸的测定都只是针对D-苹果酸和L-苹果酸混合物的含量测定，并不能有效区分这两种异构体。而本研究通过采用手性色谱柱CHIRALPAK-IC和对分析方法的优化所建立的正相高效液相色谱法，是一种分离并测定L-苹果酸及其对映异构体D-苹果酸的准确、灵敏、高效、便捷的方法。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

岛津HPLC-2010C ；CPA225D型电子天平(赛多利斯)。

L-苹果酸标准品(中国药品生物制品检定所)；DL-苹果酸标准品(中国药品生物制品检定所)； L-苹果酸原料(中照力德化工有限公司；含量：99.31%)。

1.2色谱条件

色谱柱CHIRALPAK-IC (4.6×250mm；5μm)；进样量100μL ； 测定波长210nm ；柱温：35oC；流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1；流速0.5mL/min。

1.3溶液的配制

称取一定量的DL-苹果酸标准品加流动相配制成浓度为1mg/mL的DL-苹果酸溶液；称取一定量的L-苹果酸原料加流动相配制成浓度为1mg/mL的L-苹果酸供试溶液；取L-苹果酸供试溶液用流动相稀释100倍，得到其1%自身对照溶液。D-苹果酸含量按照1%自身对照计算，其计算公式为：D-苹果酸含量(%)=A1/A2(注：A1为供试液中D-苹果酸峰面积，A2为1%自身对照溶液中L-苹果酸峰面积)。

2　结果与讨论

2.1检测波长的选择

用紫外分光光度计对L-苹果酸溶液和DL-苹果酸溶液进行紫外全波长扫描，最大吸收波长为210nm，所以确定检测波长为210nm。

2.2色谱条件的优化

取上述DL-苹果酸溶液按照上述色谱条件进行测定，对比了各条件下D-苹果酸和L-苹果酸的保留时间和分离情况，见表1。流速变化测定结果比较表明，流速越高，D-苹果酸和L-苹果酸保留时间越短，色谱柱压力越大，在流速为1.0mL/min时色谱柱压力为3.4MPa，其值较高，所以为了延长色谱柱的寿命，选择流速为0.5mL/min。通过调整流动相三相的比例得知，异丙醇浓度越大，保留时间越短，D-苹果酸与相邻峰的分离度越小，当流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸=90∶10∶0.1时，保留时间太长；当流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸=70∶30∶0.1时，保留时间太短，D-苹果酸和L-苹果酸的出峰时间间隔太短，D-苹果酸与相邻峰的分离度为2.6；当流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1时，保留时间合适， D-苹果酸峰无杂质干扰，D-苹果酸与相邻峰的分离度为3.2，分离度良好；取L-苹果酸供试液进行测定，进样量50μL和100μL对比结果显示，100μL时，D-苹果酸峰高比较合适。所以最终确定的色谱条件：进样量100uL， 测定波长210nm，柱温35℃，流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1，流速0.5mL/min。

表1　色谱条件的优化

2.3系统适用性实验

取空白溶剂、L-苹果酸供试溶液在上述色谱条件下进行测定，结果见表2。结果显示，空白溶剂对样品测定不产生干扰，L-苹果酸的保留时间为11.90min，D-苹果酸的保留时间为13.52min， L-苹果酸与相邻峰的分离度为2.6，D-苹果酸与相邻峰的分离度为2.9，理论塔板数大于5000，此方法检测L-苹果酸中的D-苹果酸敏度高，分离度良好。

表2　方法的系统适用性实验

2.4溶液稳定性

配制1mg/mL L-苹果酸供试溶液、1%自身对照溶液，按照上述色谱方法分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进样，结果见表3。结果表明，在24小时内测定D-苹果酸含量的相对标准偏差为5.78%，溶液在24小时内稳定。

表3　溶液稳定性结果

注：A为峰面积

2.5精密度

配制1mg/mL L-苹果酸供试溶液、1%自身对照溶液，按照上述色谱方法重复进样6针，结果见表4。结果表明，6次重复进样D-苹果酸含量的相对标准偏差为3.59%，精密度良好。

表4　精密度结果

注：A为峰面积

2.6方法的检出限

配制1mg/mL的L-苹果酸供试溶液，按照上述色谱方法，不断的稀释进样，当信噪比S/N为3时，即为L-苹果酸的检出限，经计算得出检出限为0.22ng。

3　结论

本实验建立了一种简单有效的测定L-苹果酸中的其对映异构体D-苹果酸的检测方法。结果表明，系统适用性实验说明此方法检测L-苹果酸中的D-苹果酸灵敏度高，分离度良好。溶液稳定性实验中，在24小时内测定D-苹果酸含量的相对标准偏差为5.78，溶液在24小时内稳定性良好。精密度实验中6次重复进样D-苹果酸含量的相对标准偏差为3.59，精密度良好。L-苹果酸的检出限为0.22ng。该方法简便、快速、有效、灵敏、具有良好的精密度，可作为L-苹果酸中的对映异构体D-苹果酸的定量分析方法。

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Determination of enantiomer D-malic acid in L-malic acid by normal-phase high performance liquid chromatography.

Duan Xianzhe1,2, Li Nan1, 2*, Tan Kaixuan1, Xie Yanshi1, Chen Liang1, Hu Yang1, Feng Zhigang1,Han Shili1, Ma Qiang1

(1.UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China; 2.CooperativeInnovationCenterforNuclearFuelCycleTechnologyandEquipment,Hengyang421001,China)

The chromatographic column was CHIRALPAK-IC ( 4.6×250mm；5um)；the mobie phase was N-hexane∶isopropyl alcohol∶trifluoroacetic acid (80:20:0.1), the flow rate was 0.5ml/min, the injection volume was 100μL, the detection wavelength was at 210 nm, and the column temperature was 35℃. In the suitability experiment, the theoretical plate number of L-malic and D-malic acids were more than 5000, the resolution between L-malic acid and its adjacent peak was 2.6, and the resolution between D-malic acid and its adjacent peak was 2.9, indicating that this method had a high sensitivity and good resolution. In the solution stability experiment, the relative standard deviation of D-malic acid concentration was 5.78% within 24 hours, demonstrating that the solution was stable within 24 hours. In the precision experiment, the relative standard deviation of the D-malic acid concentrations in six repeated sampling was 3.59%, showing a satisfactory precision of this method. The detection limit of L-malic acid was 0.22ng. This method could be used for quantitative determination of D-malic acid in the L-malic acid.

L-malic acid; enantiomer; D-malic acid; high performance liquid chromatography

国家自然科学基金(41503016)；湖南省教育厅优秀青年项目(15B201)；中国博士后科学基金(2015M582334)；南华大学博士启动基金(2014XQD08)；国防基础科研计划项目(B3720110004)；南华大学“蒸湘学者计划”。

段先哲，男，1985年出生，博士，主要从事地球化学、仪器分析等方面的研究工作。

李南，女，1985年出生，硕士，主要从事分析化学、仪器分析等方面的研究工作，E-mail：linan19851018@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.006