C4二羧酸全生物合成技术的研究现状与展望

孙小龙　付永前

摘要：富马酸、L-苹果酸和L-天冬氨酸是3种典型的C4二羧酸，目前工业化生产富马酸多采用化学合成法，以石油基富马酸为平台化合物，进一步衍生出L-苹果酸和L-天冬氨酸。依托于石油基工业生产C4二羧酸的工艺不仅带来较多负面问题，同时也限制了3种C4二羧酸在食品、医药等领域的应用。随着生物制造技术的不断发展，开发C4二羧酸全生物合成技术成为历史必然。本文对生物合成富马酸、L-苹果酸和L-天冬氨酸的现状及存在问题进行了综述，并对3种C4二羧酸的全生物合成技术的可行性及发展进行了分析与展望。

关键词：富马酸；L-苹果酸；L-天冬氨酸；生物合成

中图分类号： Q89文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-007-04

依托于石油基工业的C4二羧酸是重要的基础化工原料，其应用范围已涉及到国民生活中的各个方面，俨然成为社会稳定、人类可持续发展的重要基石。富马酸是一种典型的C4二羧酸，可广泛应用于化工、食品、医药、涂料等行业，目前全世界富马酸的需求量为00×06 t/年，我国富马酸产能就达到了（0～5）×05 t/年，其中，有40%来自江苏，主要生产企业包括常茂生化有限公司、宜兴前成有限公司、南京利邦有限公司等，其中2/3市场份额主要用于生产不饱和树脂、醇酸树脂，而纯度高于99%的食品级富马酸（主要应用于酸味剂、防腐剂、抗氧化剂、pH调节剂、饲料添加剂等领域），加上医药级富马酸盐（主要应用于临床医学上）不足市场份额的/3。目前工业上富马酸主要通过顺酐异构和糠醛氧化等化学方法制得，其制备工艺过程普遍存在生产条件苛刻、催化剂毒性大、环境污染严重等缺点，严重破坏了人类的生存环境，同时产品的安全性限制了在食品及医药领域的应用。

L-苹果酸是利用富马酸衍生的C4二羧酸之一。国内苹果酸的生产企业主要包括南京国海有限公司、常茂生化有限公司、恒康有限公司等，生产工艺主要采用石油基富马酸，通过生物酶转化合成L-苹果酸，石油基富马酸所存在的安全性同样也限制了L-苹果酸的进一步应用，然而，L-苹果酸所具有的多种特殊生理功能，如护肝、解毒、抗疲劳、减肥等，给其发展带来了巨大的市场空间，同时，L-苹果酸在某些新兴应用领域也具有巨大的市场，如南京国海开发的DME添加剂能抑制瘤胃酸中毒，提高饲料利用率，增加产奶量。此外，苹果酸作为酸味剂，在某些传统领域部分替代柠檬酸，将增加（20～30）×05 t的潜在市场[2]。

L-天冬氨酸是另外一种利用富马酸衍生的C4二羧酸，其国内生产企业主要包括江苏杰成生化有限公司、常茂生化有限公司等。其售价受到原油及石化原料的波动而变化，200年的售价在2 000元/t左右，现在生产工艺中原料及环保处理成本高，占到生产成本的0%～5%，并且消耗大量的硫酸和液氨，导致生产规模不能扩大。然而，天冬氨酸的聚合物聚天冬氨酸可广泛应用于作物生长促进剂、水处理剂等领域，同时随着L-天冬氨酸在食品医药等领域的不断扩大，市场容量会持续增加，预计今后几年需求量会达到20×05 t/年[3]。

随着石油资源的日益枯竭和不可再生资源价格的节节攀升，发展环境友好的生物基化学品的生物制造技术已成为转变经济增长方式、保障生态链良好循环、实现经济社会协调可持续发展的战略需求。生物制造技术的发展，可以高效地制备替代石油化工原料的C-C4平台化合物，进而与现代新型绿色化工技术和产业相衔接，大规模生产各种生物基化学品，实现产业结构的调整，提升传统生物技术产业竞争力。2009年OECD“面向2030生物经济施政纲领”战略报告预计，到2030年，将有35%的化学品和其他工业品来自生物制造，生物经济中生物制造产业的贡献率将占39%，超过生物医药和生物农业产业。

利用生物法合成富马酸、L-苹果酸和L-天冬氨酸等C4二羧酸，是化工行业可持续发展的必然选择，受制于当前成熟石油基催化工艺的相对低廉成本，生物基C4二羧酸的大规模产业化尚缺乏与化工产品全面竞争的优势，因此，提高产品附加值是实现其产业化生产的有效途径。随着健康理念深入人心，在食品、医药领域，利用生物法合成富马酸，继而生产出L-苹果酸、L-天冬氨酸等相关衍生产品更能符合人们消费需求和消费心理，市场前景广阔。在此，本文对生物合成富马酸、L-苹果酸和L-天冬氨酸的现状及存在问题进行综述，并对3种C4二羧酸的全生物合成技术的可行性及发展进行分析和展望。

[WTHZ]生物合成C4二羧酸的国内外发展现状

生物合成富马酸

发酵法生产富马酸的研究开始于20世纪初，Foster教授从分别来自8个不同属的4株菌株中筛选出根霉菌是生产富马酸的最佳菌株，开启了根霉菌发酵产富马酸的研究历程[4]。不过由于当时技术的局限性，生物合成富马酸还处于较低的水平，基本上处于实验室研究阶段。随着20世纪70年代爆发第次石油危机以来，世界各国科学家都开始研究生物法替代化学法合成富马酸。于是，选育性能优良的菌株，利用物美价廉且来源丰富的生物质发酵产富马酸受到了越来越多的关注，意大利、德国、美国、日本等国的学者在这方面都做了大量的工作。988年，美国Duont公司申请了有关利用根霉属真菌发酵法生产有机酸的专利，发酵碳源、氮源、无机盐及溶氧对富马酸的生产具有重要影响，发酵70 h后，富马酸的最高产量达到20 g/L，但发酵液中琥珀酸、苹果酸、α-酮戊二酸等多种杂酸含量较高，占发酵产酸比例的22%[5]。996年旋转生物膜反应分离耦合装置替代中和剂的使用，解除富马酸的产物抑制效应，在20 h内生产富马酸的平均产量多达85 g/L，但膜反应器经济成本高，不适合工业化生产[6]。我国科学家对生物合成富马酸的研究始于20世纪70年代中期，975年，山西微生物研究所的张俊贤筛选出株具有产富马酸能力的Rarrhizus，并对其发酵条件进行了初步探索。当振荡培养于含有2%的葡萄糖培养基时，富马酸产量为535 g/L，得率为446%，同时发酵液中还含有较多的副产物L-苹果酸[7]。

2006年以来，我们针对生物合成富马酸工艺中存在问题进行技术攻关，在菌种优化方面，本团队以富马酸菌株Roryzae为主要研究对象，通过紫外诱变或化学诱变等手段，以丙烯醇、溴甲酚绿为筛选标记，获得副产物乙醇含量低、富马酸产量高的突变株，该菌株已申请了专利[8-9]，奠定了米根霉发酵生产富马酸的工业化进程基础；在菌体培养方面，针对菌种培养难的问题，建立了一套逐级放大、面向工业化应用的米根霉细胞培养策略[0]，解决了实际生产中可能存在的生物量需求问题，为自固定化米根霉产富马酸的大规模工业化生产奠定了基础；在发酵调控方面，建立了双阶段溶氧调控策略，即在发酵前8 h控制溶氧浓度在80%，8 h后调至30%，富马酸产量、糖酸转化率以及富马酸生产强度分别达到了 562 g/L，542 % 和07 g/（L·h）。在该调控策略基础上，进一步开发米根霉在搅拌式反应器发酵与离子交换树脂分离耦合生产富马酸的新型工艺路线，使富马酸产量为 586 g/L，糖酸得率为076 g/g，生产强度72 g/（L·h），树脂可循环使用0批次，具有操作简便、体系稳定、操作时间长等优点[2]。

目前生物合成富马酸的生产成本，与化工法相比还有一定差距。因此，开发廉价的生物基富马酸合成路线，以及开发生物基富马酸的高附加值衍生产品如L-苹果酸、L-天冬氨酸等是未来发展方向。

2生物合成苹果酸

20世纪初，人们发现某些酵母和曲霉在代谢过程中积累苹果酸，随后世界各国陆续开展了生物合成苹果酸的研究。然而，目前发酵法生产L-苹果酸的研究还未有重大进展，正在研究的发酵法生产L-苹果酸的工艺主要有两类：一是两步发酵法，或称转化发酵法，先用一株菌株在糖质发酵液中产生富马酸，然后接入另一株菌株继续进行发酵，将富马酸转化为苹果酸。一般是先用少根根霉（Rhizopus arrhizus）或华根霉（Rhizopus chinensis）把糖质原料转化为富马酸，然后再用膜醭毕赤酵母（ichia membranefaciens）或普通变形杆菌（roteus vulgaris）及宛氏拟青霉（aecilomyces varioti）转化富马酸。日本佐佐木等[3]从假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属和球拟酵母属的23株酵母菌中发现膜醭毕赤酵母的富马酸转化率最高。而有研究结果表明[4-5]，将华根霉6508接入一定培养基，在30 ℃振荡培养 5 d，接入毕赤酵母再培养5 d，产生的苹果酸对可发酵性糖的转化率达625%。国内的胡纯铿等[6]用少根根霉A-23接入含有50 g/L葡萄糖培养基中3 d后，再接入普通变形杆菌V-8继续培养2 d，L-苹果酸浓度达733 g/L，对葡萄糖的转化率为656%。二是以曲霉为菌种的一步发酵法。直接发酵法生产L-苹果酸可追溯到928年，Yuill[7]报道在培养黄曲霉（Aspergillus flavus）时，有少量L-苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。953年，Godin[8]报道了短密青霉有产苹果酸的能力。日本学者从20世纪50年代末起，对苹果酸发酵生产进行了大量研究，Abe等[9]研究的发酵法产苹果酸最高浓度达50 g/L。99年，以色列研究者[20]在6 L搅拌罐中利用黄曲霉发酵产 L-苹果酸，通过条件优化，在葡萄糖初始浓度20 g/L、搅拌转速350 r/min、Fe2浓度2 mg/L、氮源浓度27 mg/L、磷酸盐浓度5 mol/L，以及中和剂CaCO3浓度90 g/L的条件下发酵培养92 h，产酸可达 3 g/L，对葡萄糖的实际摩尔转化率为28%，但据报道该菌产生致癌性物质黄曲霉毒素，并且伴有其他四碳酸产生。然而上述利用淀粉质原料生产L-苹果酸的微生物多为曲霉（Aspergillus sp），这些菌株大多具有糖化淀粉的能力，可以直接利用淀粉质原料，发酵工艺条件温和，与其他L-苹果酸制备方法相比具有自身的优势，但其次生代谢产物中可能存在对人体及动物有致癌作用的黄曲霉毒素，倍受争议。除利用曲霉菌外，也有人提出使用根霉菌利用糖质和营养盐培养基培养后，在满足发酵的诸条件下直接生产出L-苹果酸，然而该方法还处于研究的初步阶段。目前我们筛选到株相对高产出L-苹果酸的根霉菌，该菌株富马酸产量较低[2-22]。

由于原料成本以及技术水平的限制，以上两种工艺均未实现工业化生产。随着酶工程技术及固定化技术的发展，日本学者使用聚丙烯酰胺凝胶包埋产氨短杆菌细胞，首次实现了L-苹果酸的连续化产业化生产，00 L罐中日产酸达 54 kg。该工艺是目前L-苹果酸工业化生产的主要方法，然而，该工艺的催化底物为石油基富马酸，安全性受到了限制，从而制约了其在医药、食品等领域的应用。随着社会的进步，全生物基L-苹果酸越来越受到广大消费者的青睐。L-苹果酸的全生物合成技术的研究与开发，将为L-苹果酸在医药以及食品领域开拓非常广阔的市场。

3生物合成L-天冬氨酸

自953年，L-天冬氨酸已开始采用发酵或生物催化合成进行生产。如采用基因工程大肠杆菌以葡萄糖为碳源直接发酵生产L-天冬氨酸，或利用天冬氨酸酶催化富马酸转氨生产L-天冬氨酸。日本科学家在这方面开展了大量工作。内尾等报道用黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）的谷氨酸缺陷型突变株，在含36%葡萄糖的培养基中，30 ℃培养4 d，生产天冬氨酸 4 g/L[23]。椎尾等用黄色短杆菌[2]的柠檬酸合成酶缺失株[23]，在含36%葡萄糖的培养基中，30 ℃培养2 d，生产天冬氨酸06 g/L。后来他们进一步还用黄色短杆菌的丙酮酸激酶缺失株，在限制生物素条件下，培养2 d，由00 g/L葡萄糖生产天冬氨酸226 g/L。后藤等用5%葡萄糖培养基培养佛拉氏链霉菌生成天冬氨酸0 g/L。木下等用营养培养基或其中加05%富马酸的培养基，培养巨大芽孢杆菌 d后，添加富马酸的氨水中和液，继续培养3 d生成天冬氨酸06 g/L。

与发酵法相比，酶催化具有生产工艺简单、副产物少、易于分离精制等优点，菌种的筛选也较发酵法简单易行。木住等最先使用酶催化转化法生产天冬氨酸，即在富马酸钠和氯化铵的混合溶液中，添加啤酒酵母，利用啤酒酵母的天冬氨酸酶催化制得天冬氨酸[24]。后来，北原等用天冬氨酸酶活性高的大肠杆菌突变株的冻干菌体，由富马酸制得了天冬氨酸。接着又发现十六烷基吡啶氯化物之类的表面活性剂、高级脂肪酸等能够增加天冬氨酸收率。另外，他们还找到一种三叶假单孢菌，该菌不加表面活性剂，也能进行酶反应，培养该菌株，每升培养液可生产400 g天冬氨酸。一些研究结果还表明，可以用好热细菌、嗜热脂肪芽孢杆菌及短杆菌的α-氨基正丁酸抗性突变株的天冬氨酸酶，将富马酸转化为天冬氨酸[25]。但由于分离和固定化天冬氨酸酶的稳定性不好，973年日本田边制药株式会社把细胞固定在聚丙烯酰胺上，得到固定化全细胞作为催化剂，该工艺是第一个成功的固定化全细胞应用实例，开创了应用生物催化法生产氨基酸的先河。

日本学者高尾等人曾经开展过双菌发酵生成天冬氨酸的研究，该方法先用葡萄糖培养根霉菌进行富马酸发酵，然后接入天冬氨酸酶活性高的普通变形杆菌进行培养，把富马酸转化为天冬氨酸，最后生成天冬氨酸499 g/L，对初始糖收率为624%。该研究具有重要意义，在双菌偶联发酵上进行了一个有效的探索，但是天冬氨酸的最终浓度及对初始糖的转化率不是太高，难以实现工业化生产。

[WTHZ]2全生物合成C4二羧酸技术的发展趋势

生产成本高，缺乏与同类石油基产品的价格竞争优势是困扰绝大多数生物基大宗化学品产业化进程的世界难题。然而，随着健康理念深入人心，在食品、医药领域，利用生物法合成富马酸，针对生产成本高，无价格优势等特点，以降低大规模产业化的生产成本为核心，重点开发低廉高效的富马酸生产工艺，继而生产L-苹果酸、L-天冬氨酸等衍生产品的全生物合成路线更能符合人们消费需求和消费心理。

2生物合成富马酸的廉价工艺开发

生产成本高是阻碍生物基富马酸产业化的重要因素，降低原料成本以及提高菌种的产酸能力成为解决这一问题的关键点。以往的研究往往单纯依赖于发酵工艺的调控，以提高糖酸转化率，增强原料的利用率，所采用的原料基本为价格相对较贵的葡萄糖，发酵法制备富马酸的成本居高不下，开发廉价的生物合成富马酸路线将是降低生产成本的有效方法之一，其主要体现在：（）基于廉价原料的富马酸低成本制备技术， 采用离子注入、飞秒激光诱变或常压室温等离子体诱变等技术，选育高糖化酶活力富马酸生产菌株的育种思路，以期实现以廉价淀粉质原料发酵生产富马酸的工艺过程，拓宽米根霉发酵产富马酸的底物谱，从源头降低发酵成本；结合米根霉发酵产酸的特性，筛选合适的淀粉质原料，优化同步糖化工艺，实现米根霉利用廉价淀粉质原料高效积累富马酸的工艺路线，基于过程控制等关键技术，完成同步糖化工艺的生产方法，全面降低发酵法制备富马酸的成本；（2）基于壳聚糖/壳聚糖-富马酸联产的木质纤维素全炼制技术 采用蒸爆、酸解等技术对非粮生物质资源进行预处理，实现葡萄糖、木糖的有效分离。解析原料预处理液（主成分为木糖）中各种成分对米根霉生物量积累及壳聚糖/壳寡糖合成的作用机理，提高壳聚糖/壳寡糖的积累量，同时进一步优化米根霉利用酶解液（主成分为葡萄糖）发酵产酸，在完成分步利用非粮生物质中木糖、葡萄糖联产壳聚糖/壳寡糖与富马酸的工艺基础上，实现非粮生物质全利用。目前，我们突破传统富马酸的生产思路，创新性地提出了双阶段利用玉米秸秆中木糖、葡萄糖的工艺路线，木糖用于米根霉生物量的培养，从而收获壳聚糖/壳寡糖，葡萄糖用于米根霉的发酵产酸过程，实现富马酸的积累。该方法突破了传统方法对木质纤维素的利用局限，充分发挥菌株特性，建立秸秆类原料联产壳聚糖/壳寡糖和富马酸的工艺路线，开拓木质纤维素的利用范围，为木质纤维素的高效利用提供新的方向[26-27]。

22全生物合成L-苹果酸以及L-天冬氨酸

传统工艺中，富马酸的生产与L-苹果酸/L-天冬氨酸的生成是两个独立的过程，发酵法生产富马酸多采用钙盐法作为中和剂，后经浓缩、结晶进一步转化为L-苹果酸/L-天冬氨酸，环境污染严重、能耗大。采用发酵-酶法耦合转化生产工艺，串联富马酸的发酵过程及酶转化过程，将是解决全生物合成L-苹果酸/L-天冬氨酸问题的关键，我们已尝试利了用富马酸发酵液来生产L-天冬氨酸，并取得了初步效果[3]。因此在后期的研究，主要研究方向：（）发酵-酶法转化耦合生产L-苹果酸/L-天冬氨酸，采用双步走的技术策略，以铵盐/钠盐替换传统工艺中的钙盐，或以反应分离耦合的方式获得富马酸钠/富马酸铵，直接进入下游的酶法转化过程，生产L-苹果酸/L-天冬氨酸；（2）高效细胞催化技术，解决现有生产工艺中固定化酶使用寿命短、底物富马酸分离难度大等问题，研究不同固定化方式、不同固定化颗粒大小对底物、产物扩散速率的影响，固定化对细胞催化转化能力的影响，在不影响传质的同时防止酶的泄露，延长固定化细胞的使用寿命。

3展望

社会发展至今，人类开始追寻“源于自然、回归自然”的生活理念，要求“吃的健康、用的安心”，在这样一种消费理念下，应用于食品、饲料、医药等领域的各类石油基产品受到了严重质疑，而以生物质原料为基础的现代工业生物产品具有原料来源自然化，生产过程温和化的典型特征，能够满足人类对健康、自然的追求，符合消费者的消费需求和心理，具有较强的市场接受度。故借助微生物的自然潜能，将天然生物质资源转化成富马酸、L-苹果酸、L-天冬氨酸在食品、饲料、医药等各大行业中将具有强劲的竞争优势。因此，建立以生物质为原料联产富马酸及下游高附加值衍生产品（L-苹果酸、L-天冬氨酸）的工业微生物技术研究与应用，提升C4二羧酸高端化学品的生物制造技术水平，也将是未来C4二羧酸的研究方向和发展趋势。

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