3-溴丙酮酸磷脂复合物纳米乳的制备及其对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用

裴文俊，季麒麟，叶熊龙，张腾宇，杨庆春，姚希虹，王 秀

(蚌埠医学院药学院药剂教研室，蚌埠 233000；*通讯作者,E-mail:94492684@qq.com)

3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate，3-BP)是一种小分子烷化剂，因与体内丙酮酸、乳酸结构相似，能竞争性地与乳酸、丙酮酸蛋白结合被转运入肿瘤细胞，从而抑制肿瘤细胞内ATP的生成，切断肿瘤细胞的能量供应，通过“饿死”肿瘤细胞达到杀死肿瘤细胞的目的[1]。同时由于3-溴丙酮酸具有严重的细胞毒性和不明确的毒副作用，在国内未见临床广泛使用[2]。因此开发低毒、高效、具有靶向性的3-溴丙酮酸制剂成为临床用药的迫切需要[3,4]。

磷脂复合物(phospholipid complex，PC)系指在非质子传递溶剂中，药物与磷脂以一定配比关系结合而形成的复合物，可以改善药物的脂溶性等理化性质。3-溴丙酮酸是水溶性药物，脂溶性差，将3-溴丙酮酸制备为3-溴丙酮酸磷脂复合物(3-bromopyruvate phospholipid complex，3-BP-PC)后，显著改善其脂溶性，在制备自乳化释药系统(self-emulsifying drug delivery system，SEDDS)时能具有较好的载药量和包封率[5]。

SEDDS是由油相、乳化剂和助乳化剂组成的固体或液体制剂，其基本特征是可在胃肠道内或环境温度适宜(通常指体温37 ℃)及温和搅拌的条件下，自发乳化形成粒径在100～500 nm的纳米乳[6,7]。SEDDS具有传统乳剂的优点，乳滴分散度大，能有效增加难溶性药物的溶解度，在血管外给药途径中，形成乳滴的油相与黏膜有极好的相容性，有利于药物在黏膜内外的转运，可明显提高生物利用度；在血管内给药途径中，可以产生良好的靶向作用，减少给药次数和给药剂量，增加药物在靶器官或靶组织的富集，减少在正常组织和器官的分布，大幅减少毒副作用，是一种优良的给药系统。SEDDS临用前分散的特点，克服了乳剂贮存稳定性差的缺点；在制备时不需要特殊的设备，操作简单，并易于保存，具备低黏度、靶向特点[8]。

基于SEDDS制备需要药物具备较好的脂溶性，药物才能有效地包封于油相液滴中。本研究拟采用复合法制备3-BP-PC,正交实验筛选3-BP-PC制备方法。后将3-BP-PC通过进一步自乳化形成3-BP-PC-SEDDS,观察制剂对乳腺癌MCF-7细胞生长的影响，以期为水溶性药物3-溴丙酮酸的进一步应用提供方向。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

FA224电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；DF-101S集热式恒温加热搅拌器(金坛市金南仪器制造有限公司)；旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；傅里叶变换红外光谱仪(天津港东科技发展股份有限公司)；紫外分光光度计(日本株式会社日立高新技术科学)；STA 449-F5(德国耐驰公司)；高效液相色谱仪LC-16(岛津仪器(苏州)有限公司)。

3-溴丙酮酸(麦克林公司)；大豆卵磷脂(麦克林公司)；四噻唑蓝溴化物(MTT)(美国Amresco公司)；无水乙醇、三氯甲烷为分析纯；甲醇、乙醇为色谱纯；MCF-7细胞(蚌埠医学院科研中心供)。

1.2 方法

1.2.1 3-溴丙酮酸磷脂复合物制备及处方筛选

1.2.1.1 3-溴丙酮酸磷脂复合物制备及复合率测定 磷脂复合物的制备工艺研究：采用溶剂挥发法制备3-溴丙酮酸磷脂复合物。取处方量的3-溴丙酮酸及大豆磷脂置于圆底烧瓶中，加入无水乙醇后，磁力搅拌条件下水浴加热，缓慢搅拌至设定时间。减压旋蒸除去有机溶剂后即得3-溴丙酮酸磷脂复合物粗品。3-溴丙酮酸极微溶于三氯甲烷，而磷脂复合物在三氯甲烷中溶解度很高。加入三氯甲烷溶解3-溴丙酮酸磷脂复合物粗品，过滤除去未参加反应的游离3-溴丙酮酸，再次减压旋蒸除去三氯甲烷，置于真空干燥箱内过夜[9]。将磷脂复合物密封于封口袋内，备用。

复合率计算公式如下：

式中：M为3-溴丙酮酸的初试投入质量，单位是g；m为沉淀干燥后质量，单位是g。

1.2.1.2 3-溴丙酮酸磷脂复合物正交实验处方筛选 以药物(3-溴丙酮酸)与磷脂的复合率为考察指标，研究复合溶剂、复合物浓度、3-溴丙酮酸与磷脂的投料比(g/g)和复合温度等因素对复合率的影响。运用正交实验法对影响磷脂复合物复合率显著的3个因素，即复合物浓度、3-溴丙酮酸与磷脂的投料比(g/g)、复合温度[10,11]等进行处方筛选。

1.2.2 3-BP-PC的验证及表征

1.2.2.1 差示扫描量热(DSC)分析 以铝坩埚为参比，温度扫描范围为25～800 ℃，升温速度5 ℃/min，N2既为保护气又为吹扫气，分别取3-溴丙酮酸、大豆磷脂、二者物理混合物及3-溴丙酮酸磷脂复合物进行差示扫描量热分析[12]。

1.2.2.2 紫外光谱分析(UV) 分别取3-溴丙酮酸、大豆磷脂、二者物理混合物及3-溴丙酮酸磷脂复合物适量，用甲醇溶解，于波长200～400 nm进行扫描[13]，比较各组紫外吸收的差异。

1.2.2.3 傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析 分别取3-溴丙酮酸、大豆磷脂、二者混合物及3-溴丙酮酸磷脂复合物适量，与溴化钾混合均匀、压片，于400～4 000 cm-1范围进行扫描。

1.2.2.4 透射电镜(TEM)分析 取3-BP-PC 200 mg于EP管中，逐滴加入30 ℃纯水，温和搅拌自乳化，得到乳白色带淡蓝色乳光。将该乳液滴在覆有支持膜的铜网上，静置10 min，用滤纸片吸干水分，滴加3%磷钨酸溶液于铜网上负染5 min，自然挥干，透射电镜观察[14]。

1.2.2.5 马尔文粒度电位仪分析 取适量3-BP-PC加甲醇溶解稀释形成溶液后，使用马尔文粒度电位仪测定乳剂的粒径及Zeta电位。

1.2.3 3-溴丙酮酸磷脂复合物自乳化纳米乳制备及表征

1.2.3.1 3-溴丙酮酸磷脂复合物自乳化纳米乳制备 自乳化纳米乳制备工艺根据Liu等[15]关于自乳化纳米乳研究的结果，实验最终选择以肉豆蔻酸异丙酯 ∶Tween-80 ∶无水乙醇为6 ∶3 ∶1混合作为溶剂，油相(3-溴丙酮酸磷脂复合物)与混合乳化剂质量比为2 ∶8制备3-溴丙酮酸磷脂复合物自乳化纳米乳。

1.2.3.2 3-溴丙酮酸磷脂复合物自乳化纳米乳表征 ①透射电镜(TEM)分析：取3-溴丙酮酸纳米乳200 mg于EP管中，逐滴加入30 ℃纯水，温和搅拌自乳化，得到乳白色带淡蓝色乳光。将该乳液滴在覆有支持膜的铜网上，静置10 min，用滤纸片吸干水分，滴加3%磷钨酸溶液于铜网上负染5 min，自然挥干，透射电镜观察。②马尔文粒度电位仪分析：取适量3-溴丙酮酸磷脂复合物自微乳加水稀释成溶液后，使用马尔文粒度电位仪测定乳剂的粒径及Zeta电位。

1.2.4 3-溴丙酮酸纳米乳抑制乳腺癌作用研究

1.2.4.1 MTT法测定3-溴丙酮酸纳米乳对MCF-7细胞的抑制作用 使用MTT法测定细胞存活率，按照其说明书进行使用。体外培养乳腺癌MCF-7细胞，取对数生长期的MCF-7细胞使用胰蛋白酶进行消化，以5×103cells/孔的密度接种于96孔板中，每组设3个平行复孔。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，观察细胞贴壁良好，密度适宜。对照组使用新鲜培养液，而实验组使用含药培养液处理，实验组浓度设置如下:3-溴丙酮酸单药、3-溴丙酮酸磷脂复合物、3-溴丙酮酸自微乳各处理24，48 h，每组药物设5个不同浓度，使3-溴丙酮酸终浓度分别为10，20，40，80，160 μmol/L，然后将其放回37 ℃，5% CO2培养箱孵育。24 h后每孔加入20 μl MTT溶液，于培养箱中孵育4 h，使用多功能酶标仪于490 nm波长处检测其吸光度A值，记录数据，使用空白孔调零，以对照组为100%，计算各组细胞存活率(细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%)。

1.2.4.2 Calcein AM/PI染色测定3-溴丙酮酸纳米乳对MCF-7细胞的抑制作用 取指数生长期乳腺癌MCF-7细胞，以3.0×105个/孔细胞的密度接种于6孔板，对照组使用新鲜培养液，而实验组使用含药培养液处理，实验组设置如下:3-溴丙酮酸单药、3-溴丙酮酸磷脂复合物、3-溴丙酮酸自微乳各处理24 h，每组药物给药浓度为40 μmol/L。在37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后，按照试剂盒操作步骤，采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯(CAM)和碘化丙啶(PI)法鉴定活细胞(绿色荧光)和死细胞(红色荧光)，加入足够量的Calcein AM/PI染色工作液，室温避光孵育20 min后，荧光显微镜下观察红绿荧光的强度从而比较3-溴丙酮酸单药、3-溴丙酮酸磷脂复合物和3-溴丙酮酸纳米乳对MCF-7细胞的抑制增殖能力。

1.2.4.3 集落克隆试验测定3-溴丙酮酸纳米乳对MCF-7细胞抑制作用 体外培养乳腺癌MCF-7细胞，取对数生长期的MCF-7细胞使用胰蛋白酶进行消化，使用血细胞计数板法进行计数，随后稀释成所需浓度的细胞悬液，以5×103cells/孔的密度接种于6孔板中，待其贴壁后对照组使用新鲜培养液，而实验组使用含药培养液处理，实验组设置如下:3-溴丙酮酸单药、3-溴丙酮酸磷脂复合物、3-溴丙酮酸自微乳，药物浓度为5 μmol/L处理，放置于培养箱中，10 d后使用显微镜观察其集落形成情况。弃去培养液后，使用PBS冲洗一遍。随后使用4%多聚甲醛进行固定0.5 h，弃去多聚甲醛，使用PBS冲洗一遍后，加入结晶紫染液染色0.5 h，弃去结晶紫，倒扣在纸上待其干后进行拍照，比较不同处理组集落形成能力差别。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 3-BP-PC正交实验处方筛选结果

以三因素三水平正交实验设计优化磷脂复合物的制备工艺，通过对复合物浓度、3-溴丙酮酸与磷脂的投料比(g/g)、复合温度3个因素，及各因素对应水平进行考察，并对实验结果进行拟合分析。正交实验各因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

正交实验显示，该实验最佳工艺为A3B2C2(见表2)，即选用3-溴丙酮酸与大豆磷脂药脂比(g/g)为1 ∶3，温度40 ℃，药物浓度10 mg/ml，同时复合时间为2.5 h(n=3)。

表2 3-BP-PC制备的正交实验结果分析 (n=3)

2.2 3-BP-PC的验证及表征

2.2.1 3-BP-PC的DSC分析 3-溴丙酮酸、大豆磷脂、二者物理混合物和3-溴丙酮酸磷脂复合物的DSC图谱见图1，在4 min时，磷脂复合物有与3-溴丙酮酸相似的吸放热特征，表明磷脂复合物中有3-溴丙酮酸存在。此外，磷脂复合物的DSC图谱与大豆磷脂的DSC图谱相比也具有相似的吸放热特征。说明磷脂复合物中也确实有大豆磷脂存在。

图1 3-溴丙酮酸、大豆磷脂、3-溴丙酮酸磷脂复合物及其物理混合物的DSC图谱Figure 1 DSC characterization of 3-BP, PC, 3-bromopyruvate phospholipid complex and physical mixtures

2.2.2 3-BP-PC的UV表征 3-溴丙酮酸、大豆磷脂、二者物理混合物和3-溴丙酮酸磷脂复合物紫外图谱见图2，3-溴丙酮酸和磷脂复合物均在210 nm附近有吸收峰，表明两种物质的发色团，结构没有发生变化，没有产生新的物质[16]。

图2 3-溴丙酮酸、大豆磷脂、3-溴丙酮酸磷脂复合物及其物理混合物的紫外图谱Figure 2 UV characterization of 3-BP, PC, 3-bromopyruvate phospholipid complex and physical mixtures

2.2.3 3-BP-PC的FT-IR表征 3-溴丙酮酸、大豆磷脂、二者物理混合物和3-溴丙酮酸磷脂复合物的红外图谱见图3，结果可知，大豆磷脂的C=O吸收峰为1 727.9 cm-1，P=O吸收峰为1 452.14 cm-1；物理混合物的C=O吸收峰在1 731.36 cm-1，C-H的吸收峰在2 850.2 cm-1,2 910.0 cm-1处；磷脂复合物的OH吸收峰出现在3 479.78 cm-1处，而C=O吸收峰在1 739.66 cm-1处。由图可知，物理混合物的红外谱图是3-溴丙酮酸和大豆磷脂红外谱图的叠加，其特征峰相较于大豆磷脂和3-BP分子没有明显变化，二者在物理混合过程中没有发生物理化学反应[17]。

图3 3-溴丙酮酸、大豆磷脂、3-溴丙酮酸磷脂复合物及其物理混合物的红外图谱Figure 3 FT-IR characterization of 3-BP, PC, 3-bromopyruvate phospholipid complex and physical mixtures

2.2.4 3-BP-PC的透射电镜(TEM)表征 TEM分析结果显示，制得的磷脂复合物表面光滑，呈球型结构(见图4)。

图4 透射电镜下观察3-溴丙酮酸磷脂复合物的表观结构 (×50 000 zoom-1，120.0 kV)Figure 4 TEM characterization of 3-bromopyruvate phospholipid complex (×50 000 zoom-1，120.0 kV)

2.2.5 3-BP-PC的粒径表征 取适量3-BP-PC-SEDDS加水稀释形成乳剂后，使用马尔文粒度仪测定乳剂的粒径及聚合物分散性指数(polymer dispersity index，PDI),结果见图5，3-溴丙酮酸磷脂复合物平均粒径为(355.00±19.50)nm(n=3)，PDI值为0.27±0.08(n=3)。

2.3 3-溴丙酮酸纳米乳表征

2.3.1 TEM分析 结果表明将磷脂复合物经过自乳化处理后，制得的3-溴丙酮酸纳米乳呈近球型(见图6)，且直径大小符合制备要求。

2.3.2 马尔文粒度电位仪分析 取适量3-溴丙酮酸磷脂复合物纳米乳加水稀释成溶液后，使用马尔文粒度电位仪测定乳剂的粒径及PDI值，结果见图7，3-溴丙酮酸磷脂复合物自乳化纳米乳粒径为(97.35±3.44)nm(n=3)，PDI值为0.22±0.02(n=3)。

图7 3-溴丙酮酸纳米乳的粒径图Figure 7 Particle size characterization of 3-bromopyruvate nano-emulsion

2.4 3-溴丙酮酸磷脂复合物自乳化纳米乳对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用

2.4.1 MTT法测定细胞存活 MTT结果显示，不同浓度3-溴丙酮酸纳米乳均可抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，并呈现浓度依赖性(见图8)，10，20，40，80，160 μmol/L的3-溴丙酮酸纳米乳浓度组的细胞存活率分别为(81.83±2.67)%，(58.24±1.95)%，(44.30±4.62)%，(20.10±1.62)%，(12.53±1.16)%。结果表明，与3-溴丙酮酸相比，3-BP-PC-SEDDS在10，40，160 μmol/L时，均呈现出对乳腺癌细胞良好的抑制作用(P<0.05)。

2.4.2 Calcein AM/PI染色法测定细胞存活 与对照组相比，3-溴丙酮酸、3-溴丙酮酸磷脂复合物和3-溴丙酮酸纳米乳红色区域均有所增加。而且，与3-溴丙酮酸单药和3-溴丙酮酸磷脂复合物相比，3-溴丙酮酸纳米乳组死细胞数量增加最为明显(见图9)。

与3-BP相比,*P<0.05，**P<0.01图8 不同浓度的3-BP、3-BP-PC和3-BP-PC-SEDDS对MCF-7细胞增殖的抑制作用Figure 8 Inhibitory effect of 3-BP, 3-BP-PC, 3-BP-PC-SEDDS on MCF-7 cell proliferation at different concentrations

活细胞为绿色，死细胞为红色图9 Calcein AM/PI染色检测3-溴丙酮酸纳米乳对MCF-7细胞的影响Figure 9 Effects of 3-bromopyruvate nano-emulsion on MCF-7 cells by Calcein AM /PI staining

2.4.3 集落克隆形成实验 集落克隆形成实验结果显示，与对照组相比，3-溴丙酮酸单药、3-溴丙酮酸磷脂复合物和3-溴丙酮酸纳米乳均能抑制MCF-7细胞集落克隆形成；与3-溴丙酮酸单药、3-溴丙酮酸磷脂复合物相比，3-溴丙酮酸纳米乳抑制效果最好，克隆数量最少(见图10)。

A.对照组；B. 3-溴丙酮酸；C. 3-溴丙酮酸磷脂复合物；D. 3-溴丙酮酸纳米乳图10 3-溴丙酮酸纳米乳对MCF-7细胞集落克隆形成的影响Figure 10 Inhibitory effect of 3-bromopyruvate nano-emulsion on colony formation of MCF-7 cells

3 讨论

乳腺癌已经成为中国女性恶性肿瘤发生概率最高的癌症，严重威胁着女性的身心健康，发病率以及死亡率呈逐年上升的趋势，并且更趋于年轻化。因此，寻找一种有效治疗乳腺癌的治疗手段显得至关重要。Kim等[18]也在其细胞学实验中指出，3-溴丙酮酸通过抑制肿瘤细胞的糖代谢途径、减少ATP的合成，抑制肿瘤细胞的生长、增殖，提高癌细胞的凋亡比例。因此，制备增效低毒的3-BP-PC-SEDDS是应对乳腺癌的有效方法。

由于药物具有一定脂溶性才能更利于在临床应用，而3-溴丙酮酸水溶性强，生物利用度稍差，限制了其临床疗效的发挥。通过对3-溴丙酮酸磷脂复合物制备的研究，我们通过差示扫描量热(DSC)分析结果可知，在4 min时，磷脂复合物有与3-溴丙酮酸相似而大的吸收峰，证实3-溴丙酮酸成功制得磷脂复合物。而在60 min时，磷脂复合物没有出现3-溴丙酮酸的对应宽大吸收峰，这可能是3-溴丙酮酸与磷脂复合物在结合时发生了分子间相互作用所致。此外，磷脂复合物的DSC图谱与大豆磷脂的DSC图谱相比都具有相似的吸放热特征。说明磷脂复合物中也有大豆磷脂存在。综上所述，大豆磷脂和3-溴丙酮酸成功制得磷脂复合物。另外，紫外光谱分析(UV)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析结果也与上述结果相一致。之后为了得到高复合率的复合物，本研究通过对温度、药脂比(g/g)、药物浓度进行改进，将其磷脂复合物的复合率提高到92%，提高了在油相中的溶解度，并进一步通过自乳化途径将3-溴丙酮酸磷脂复合物制备成3-溴丙酮酸纳米乳，而且制备得到的3-溴丙酮酸纳米乳粒径为(97.35±3.44)nm(n=3)，PDI值为0.22±0.02(n=3)。即在形成纳米乳后，制剂粒径明显减小，有利于增加肿瘤细胞摄取，从而增加药效。

通过MTT法和PI荧光染色法比较3-溴丙酮酸单药、3-溴丙酮酸磷脂复合物、3-溴丙酮酸纳米乳对细胞活力影响。3-溴丙酮酸磷脂复合物相较于3-溴丙酮酸单药抑制细胞增殖作用并不明显，但是最终制剂3-溴丙酮酸纳米乳相较于单药，呈现出明显的细胞抑制作用。之后的集落克隆实验表明与对照组相比，3-溴丙酮酸单药、3-溴丙酮酸磷脂复合物和3-溴丙酮酸纳米乳均能抑制MCF-7细胞集落克隆形成，但是与前两者相比，3-溴丙酮酸纳米乳抑制效果最好，克隆数量最少。

综上，研究表明制备的3-溴丙酮酸纳米乳不但增加3-溴丙酮酸临床用药的疗效，而且通过对3-溴丙酮酸磷脂复合物自乳化给药系统的研究，为水溶性药物磷脂复合物的临床给药提供更多方向。