云南地区傣族、汉族人群RAGE基因多态性与糖尿病视网膜病变的相关性

陶 丹,刘泽源,王 贺,王勇刚

(昆明市儿童医院眼科,昆明 650028)

随着现阶段人口老龄化和城市化进程的加剧，糖尿病发生率呈现逐年升高的趋势。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)属于糖尿病主要眼部并发症类型，同时也是致盲的主要因素之一[1]。目前为止，我国糖尿病患者已超过1亿，且在这其中有相当一部分患者可能发生DR。糖尿病患者DR发病机制主要包括糖基化终末产物堆积、视网膜生长因子异常表达、炎性因子增加、视网膜毛细血管血流变化等[2]。糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是糖醛基与蛋白质氨基二者经非酶糖基化反应生成，属于不可逆的异源大分子物质，在视网膜神经细胞组织中堆积是致使DR发生的主要病因之一[3]。糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是一种膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，糖尿病、炎症、肿瘤疾病的发生发展中均发挥极其重要的作用。近年来，随着分子生物学、遗传学的飞速发展，以及人类基因组计划的开展，疾病发生和发展中易感基因型的作用越来越受到研究人员的关注和重视，从遗传学的角度来讨论基因突变与DR疾病发生发展的关系，具有深远且重大的意义[4]。作为研究DR的候选基因之一，RAGE基因序列的改变可能影响AGEs-RAGE间的作用，进而影响疾病进程。云南省有25个少数民族，本研究选择昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群、西双版纳地区傣族人群分别探讨其RAGE基因多态性与DR发生的关系，旨在早期发现DR易感人群，采取相应措施。

1 对象与方法

1.1 病例来源

本研究采用多阶段分层抽样的方法，以云南省第一人民医院、西双版纳傣族自治州人民医院、景洪市第一人民医院3家医院收治患者及体检为抽样对象，分别选取2020年3月至2021年2月昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群、西双版纳地区傣族人群各150例，每个地区或民族中包括正常对照人群50例，糖尿病未合并视网膜病变50例，糖尿病合并视网膜病变50例，分别纳入对照组、NDR组和DR组。糖尿病患者均符合1999年WHO糖尿病诊断标准[5]，糖尿病确诊时年龄≥30岁，DR患者符合糖尿病视网膜病变治疗指南相关标准[6]，纳入对象相互间不具备血缘关系；排除肝功能异常、糖尿病酮症、急性心力衰竭、脑梗死、脑出血等患者。

1.2 主要试剂

基因组DNA提取试剂：全血基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技)，琼脂糖(Invitrogen公司)，2×Taq PCR Master Mix(北京全式金生物工程技术)，5 000 bp DNA分子量marker(TaKaRa公司)，溴化乙锭(北京鼎国公司)，5 000 bp DNA分子量marker(TaKaRa公司)，其他试剂：无水酒精，异丙醇等(国产分析纯产品)。

1.3 基因组DNA提取

抽取纳入对象5 ml空腹静脉血，加入2～3倍体积红细胞裂解液，用血液基因组试剂盒提取DNA，得到高质量的基因组DNA，样本检测纯度合格后，-80 ℃保存直至检测。引物序列：①RAGE基因-374T/A位点上游：5′-GGGGCAGTTCTCTCCTC-ACT-3′，下游：5′-GGTTCAGGCCAGACTGTTGT-3′；②RAGE基因2184A/G位点上游：5′-TAATTTCCTGCCCCATTCTG-3′，下游：5′-CATCGCAATCTATGCCTCCT-3′；③RAGE基因2245G/A位点上游：5′-ACACTTTGGGAGGCTGCTGC-3′，下游：5′-CCACCATGCCTGGCTAATTTTGT-3′。引物合成由上海生工公司进行。

1.4 基因型分析

目的基因片段的PCR扩增及测序：①PCR反应体系：PCR反应总体系10 μl，其中RAGE基因374T/A位点、2184A/G位点、2245G/A位点上游引物与下游引物各0.2 μl、PCR Mix 5.0 μl、模板DNA 1.0 μl、灭菌双蒸水2.6 μl；②PCR扩增循环过程：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min；③PCR扩增产物的凝胶电泳鉴定：PCR反应后，取4 μl PCR扩增产物与1.0 μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合，上样，3.0% TAE琼脂糖凝胶电泳，电压120 V，电泳30 min，以5 000 bp DNA Marker为分子量标准，结束后凝胶成像系统照相；④PCR产物测序：将扩增出目的条带DNA产物纯化后送上海生工测序。

1.5 统计学分析

采用SPSS22.0统计学软件，计数资料通过百分率(%)表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率分析，比较昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群、西双版纳地区傣族人群RAGE基因374T/A位点、2184A/G位点、2245G/A位点基因型和基因频率分布差异，并根据患者糖尿病以及DR发生情况，对比同一地区同一民族下对照组、NDR组和DR组RAGE基因374T/A位点、2184A/G位点、2245G/A位点基因型和基因频率分布差异；采用Logistic分析糖尿病患者视网膜病变发生的危险基因型；P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 聚合酶链反应-直接测序分析

RAGE基因-374T/A、2184A/G、2245G/A多态性的PCR扩增产物使用2.0%TAE琼脂糖凝胶进行电泳，以5 000 bp DNA Marker为分子量标准，所得RAGE基因-374T/A、2184A/G、2245G/A多态性的PCR扩增片段长度分别为250 bp(见图1)、396 bp(见图2)、116 bp(见图3)。由电泳结果可见PCR扩增产物的含量尚可、无明显杂带，可用于下一步的测序分析。

1. 5 000 bp DNA Marker；2～7. PCR扩增产物图1 RAGE基因-374T/A多态性的PCR产物电泳结果Figure 1 Electrophoresis results of PCR products in RAGE -374T/A polymorphisms

1. 5 000bp DNA Marker;2～5. PCR扩增产物图3 RAGE基因2245G/A多态性的PCR产物电泳结果Figure 3 Electrophoresis results of PCR products in RAGE 2245G/A polymorphisms

2.2 DR组、NDR组以及对照组RAGE -374T/A基因多态性分析

昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群和西双版纳地区傣族人群中正常对照组、DR组及NDR组之间的RAGE -374T/A基因型分析显示，TT、TA和AA的分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律检验(P>0.05)。西双版纳地区傣族人群中DR组RAGE -374T/A位点TT基因型的分布频率与对照组及NDR组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中DR组TT频率低于对照组和NDR组，TA和AA基因型的分布频率在三组间无显著差异；而DR组RAGE -374T等位基因分布频率较对照组(χ2=4.934，P<0.05)和NDR组(χ2=4.058，P<0.05)显著降低，A等位基因分布频率较对照组(χ2=7.812，P<0.05)和NDR组(χ2=5.922，P<0.05)显著增加。昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群中对照组、DR组及NDR组间RAGE -374T/A位点基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 DR组、NDR组以及对照组RAGE -374T/A基因多态性分析 (%)

2.3 DR组、NDR组以及对照组RAGE 2184A/G基因多态性分析

昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群、西双版纳地区傣族人群中正常对照组、DR组及NDR组之间的RAGE2184A/G基因型分析显示，AA、AG和GG的分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律检验(P>0.05)。西双版纳地区傣族人群中DR组RAGE 2184A/G位点GG基因型的分布频率与对照组及NDR组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中DR组GG频率高于对照组和NDR组，AA和AG基因型的分布频率在三组间无显著差异；而DR组RAGE 2184A等位基因分布频率较对照组(χ2=13.781，P<0.05)和NDR组(χ2=5.604，P<0.05)显著降低，G等位基因分布频率较对照组(χ2=11.416，P<0.05)和NDR组(χ2=4.596，P<0.05)显著增加。昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群中对照组、DR组及NDR组RAGE 2184 A/G位点基因型与等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表2 DR组、NDR组以及对照组RAGE 2184A/G基因多态性分析 (%)

2.4 DR组、NDR组以及对照组RAGE 2245G/A基因多态性分析

昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群、西双版纳地区傣族人群中正常对照组、DR组及NDR组之间的RAGE 2245G/A基因型分析显示，三组均有GG和GA基因型存在，且RAGE 2245G/A基因型GG和GA的分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律检验(P>0.05)。西双版纳地区傣族人群中DR组RAGE 2245G/A位点GG、GA基因型的分布频率与对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中DR组GG频率低于对照组(P<0.05)，GA频率高于对照组(P<0.05)；而DR组RAGE 2245G等位基因分布频率较对照组显著降低(χ2=1.52，P<0.05)，A等位基因分布频率较对照组显著增加(χ2=2.11，P<0.05)；而NDR组RAGE 2245G/A位点GG、GA基因型的分布频率与对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中NDR组GG频率低于对照组(P<0.05)，GA频率高于对照组(P<0.05)，NDR组RAGE 2245G等位基因分布频率较对照组显著降低(χ2=1.86，P<0.05)，A等位基因分布频率较对照组(显著增加χ2=2.01，P<0.05)。昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群中对照组、DR组及NDR组RAGE 2245G/A位点基因型与等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

表3 DR组、NDR组以及对照组RAGE 2245G/A基因多态性分析 (%)

2.5 西双版纳地区傣族糖尿病患者RAGE基因多态性与DR发生风险关联分析

利用非条件Logistic回归模型计算校正性别、年龄、糖尿病病程后的OR及95%CI，结果显示RAGE -374T/A位点TA+AA基因型是西双版纳地区傣族糖尿病患者DR发生的危险基因型，OR值为1.619(95%CI：1.172～2.238)；RAGE 2184G/A位点AG+GG基因型是西双版纳地区傣族糖尿病患者DR发生的危险基因型，OR值为1.667，95%CI：1.140～2.438(见表4)。

表4 西双版纳地区傣族糖尿病患者RAGE基因多态性与DR发生风险关联分析

3 讨论

DR的发生、发展与多种因素相关，包括血糖控制效果、糖尿病病程、血压水平、环境因素、遗传因素等[7]。相关研究显示[8]，有效的血糖和血压控制可延缓或减轻DR发生和发展，却不能彻底阻止。除了高血糖及环境因素外，遗传因素也在DR的发生与发展中具有相当重要的作用[9]。

RAGE属免疫球蛋白超家族多配体受体，在肺脏外的多个组织器官中均呈现低表达，作为跨细胞膜信息传递通道，于多种细胞表面表达，可引起大量生成反应性氧化基团，产生强烈的氧化应激反应，后者又可激活转录因子，与炎症反应、细胞黏附、凝血、组织生长等密切相关，最终导致病理性改变。人RAGE基因位于6p21.3，含外显子11个，原始翻译产物含氨基酸残基383个，氨基端22个氨基酸残基均为信号肽。相关研究结果显示[10,11]，无论是糖尿病患者还是糖尿病动物模型，在视网膜、肾小球系膜等组织中AGEs积聚的区域，RAGE均呈现高表达。Chen等[12]研究发现阻断RAGE与AGEs结合可减轻血-视网膜屏障破坏，改善小鼠DR病变程度，间接证实RAGE在DR的发生发展中具有重要作用。

本研究中昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群、西双版纳地区傣族人群不同地区或民族RAGE基因-374T/A、2184A/G、2245G/A基因位点基因分型与等位基因分布无明显差异。西双版纳傣族人群中DR组RAGE基因启动子区-374T/A位点A等位基因频率分布显著高于NDR组及对照组，但NDR组与对照组的各基因型及等位基因频率分布比较无差异，说明A等位基因可能是促进西双版纳地区傣族人群DR发生和进展的因子，但并非是致使糖尿病发生发展的因素。Logistic回归分析结果显示，RAGE -374T/A位点TA+AA基因型的西双版纳地区傣族糖尿病患者DR发生风险是TT基因型的1.619倍，由此推测RAGE基因-374T/A位点多态性与西双版纳地区傣族糖尿病患者DR的发生有关，且A等位基因是DR发生的危险因素。这可能是由于RAGE启动子区-374T置换为A可提高转录因子对RAGE基因启动区的亲和力，诱导转录因子结合，形成复合体，影响转录活性。 Li等[13]研究认为RAGE基因2184A/G位点多态性与2型糖尿病DR发生相关，其中G等位基因是引起DR的危险因素。本研究显示昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群中DR组、NDR组及对照组RAGE基因2184A/G位点基因型及基因频率比较无明显差异，但西双版纳地区傣族人群中DR组2184A/G位点G等位基因频率高于NDR组与对照组，Logistic回归分析发现，AG+GG基因型患者DR发生风险达到AA基因型号的1.667倍，由此推测RAGE基因2184A/G多态性与西双版纳地区傣族DR的发生有一定的相关性，且G等位基因为DR发生的危险因素。2184A/G位点基因多态性与机体血清抗氧化剂水平相关，而糖尿病血管病变又与血清抗氧化剂水平有关，RAGE基因2184A/G位点A-G置换可能通过影响机体内的抗氧化剂血清水平增加糖尿病血管病变发生风险[14]。

本研究中从其基因型及基因频率分布结果可知，正常对照组中昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群、西双版纳地区傣族人群G等位基因频率为89.0%，91.0%，92.0%；A等位基因频率为11.0%，9.0%，8.0%，不同地区或民族G、A基因频率分布比较无显著差异。Tao等[15]对马来西亚人群研究显示，RAGE基因2245G/A位点多态性与2型糖尿病患者视网膜病变发生的风险无关。本研究中，昆明地区汉族人群、西双版纳地区汉族人群、西双版纳地区傣族人群DR组与NDR组比较RAGE基因2245G/A位点基因型及基因频率分布比较无明显差异，与上述研究结果一致，说明RAGE基因2245G/A位点多态性不影响糖尿病患者DR的发生发展。值得注意的是，本研究对于西双版纳地区傣族人群的研究显示DR组与NDR组RAGE基因2245G/A位点A等位基因频率均高于对照组，GG基因型频率低于对照组，GA基因型频率高于对照组，说明RAGE基因2245G/A位点A等位基因虽不增加糖尿病患者视网膜病变发生，但其增加了糖尿病发生风险，从而也就增加了DR的发生。

综上所述，云南西双版纳地区傣族人群RAGE基因-374T/A位点A等位基因、2184A/G位点G等位基因增加了糖尿病患者视网膜病变发生风险，2245G/A位点多态性虽与糖尿病患者视网膜病变的发生无关，但其A等位基因增加了正常人群发生糖尿病的风险，进而可能影响DR的发生。